Profil boli hepatice autoimune-Blot (AMA-M2, M2-3E, Sp100, PML, gp210, LKM-1, LC-1, SLA/LP, Ro-52)

Laborator Synevo

 

Informaţii generale

Bolile autoimune ale ficatului  includ:

• Hepatita autoimună (AIH)
• Ciroza biliară primitivă (PBC)
• Colangita sclerozantă primitivă (PSC)¹.

  Hepatita autoimună (AIH) este o boală inflamatorie cronică de etiologie neprecizată caracterizată prin prezenţa de autoanticorpi circulanţi, hipergamaglobulinemie, tablou histopatologic cu necroza celulelor parenchimatoase şi infiltrat inflamator limfoplasmocitar, precum şi printr-un răspuns dramatic la terapia imunosupresoare.

 Mecanismul patogenic  postulează că, pe fondul unei  predispoziţii  genetice, intervenţia anumitor  factori declanşatori  determină  un răspuns  imun anormal mediat de limfocitele T  ce va conduce la   leziuni ale ficatului. Date  publicate au arătat că 40% din pacienţii cu boală severă netratată suferă deces în  6 luni de la diagnostic iar supravieţuitorii dezvoltă frecvent  ciroză, varice esofagiene şi hemoragii.  Astfel, cu cât terapia imunosupresoare este începută  mai precoce şi continuată  în mod  susţinut, cu atât pacientul diagnosticat cu hepatită autoimună  are o speranţă de viaţă  mai mare.

AIH constituie o afecţiune rară cu o incidenţă medie de 1-2 cazuri la 100 000 locuitori. Deşi boala este întâlnită predominant la femeile tinere aceasta poate afecta copii şi adulţi de orice vârstă, din toate grupurile etnice.

Debutul AIH este insidios cu fatigabilitate, greaţă, dureri articulare şi icter intermitent.

Diagnosticul se bazează pe simptomele şi  semnele clinice,  testele de laborator şi evidenţierea  reacţiei inflamatorii histologice. Este importantă  excluderea  altor cauze de hepatita cronică  (virală, metabolică, genetică  sau  toxică) şi delimitarea de celelalte boli autoimune  hepatice. Principalele criterii pentru diagnosticul AIH  sunt următoarele:

• Evidenţa histologică a hepatitei
• Detecţia de autoanticorpi (ANA, ASMA, LKM, SLA/LP)
• Hipergamaglobulinemia
• Teste serologice   negative  pentru HCV şi HBV
• Asocierea cu antigenele HLA B8, DR3 sau DR4.

 

Diagnosticul  este  foarte probabil atunci când  sunt indeplinite 4 din 5 criterii  şi complet când sunt întrunite toate cele 5 criterii. Răspunsul favorabil la terapia imunosupresoare confirmă diagnosticul^1;2;3;6.

 În 1994  a fost propusă o clasificare a  AIH  în 3 tipuri majore: tip I (asociat cu  ANA şi/sau ASMA), tipul II (asociat cu  anti-LKM1 şi/sau anti-LC) şi tipul III (asociat cu anti-SLA /LP). Tipul III de boală este controversat în sensul că nu este clar dacă acesta constituie o entitate în sine sau este o variantă a tipului I^2;5;6.

 Autoanticorpii apar la majoritatea pacienţilor cu AHI, dar rolul lor în patogeneză este încă discutabil. De  asemenea, nu  există o corelaţie clară între  activitatea  sau prognosticul bolii  şi titrul de autoanticorpi.

 Principalii autoanticorpi  asociaţi cu  AIH  sunt:

• Anticorpii antinucleari (ANA)
• Anticorpii anti – fibră musculară  netedă (ASMA)
• Anticorpii anti-LKM1
• Anticorpii anti-LC1 (liver cytosol type 1)
• Anticorpii anti-SLA (soluble liver antigen)/LP (liver-pancreas)^1;4;6.

 Anti-LKM1  recunosc ca antigen ţintă citocromul p450 2D6 (CYP2D6)  de 50 kDa, antigen microsomal din reticulul endoplasmic. Anticorpii sunt  îndreptaţi către un epitop situat între aminoacizii 263-270 ai CYP2D6. Expresia acestui antigen la suprafaţa  hepatocitelor ar putea sugera rolul patogenic al acestor anticorpi. Ei se întâlnesc cu o frecvenţă  mai mare în populaţia pediatrică unde  titrul lor poate fi utilizat pentru a monitoriza  activitatea bolii şi răspunsul la tratament.  Anti-LKM1 mai pot fi întâlniţi cu frecvenţă redusă (1-2% din cazuri) la pacienţii având hepatită cronică cu virus C precum şi în hepatita la halotan.

ASMA  sunt îndreptaţi împotriva unor structuri din  componenţa citoscheletului  ca actina, troponina, tropomiozina, vimentina (predominant  împotriva F-actinei). ASMA  au fost   detectaţi prin imunofluorescenţă indirectă pe stomac, rinichi  şi ficat de rozătoare, deoarece acestea conţin cantităţi crescute de actină în structura musculară. Autoanticorpii anti-actină  se asociază cu debutul precoce al  bolii (au relevanţă crescută în patologia  pediatrică), cu prezenţa haplotipului  HLA A1-B8-DR3, cu recăderi frecvente ale tratamentului şi cu indicaţie de transplant^1;4;7.

 Anti-SLA au fost descrişi în 1987 ca fiind îndreptaţi împotriva  unei proteine din citosol care se găseşte în concentraţii crescute în ţesutul hepatic şi renal. Anti-LP au fost descrişi înaintea anti-SLA (1981), de către un grup diferit de cercetători, ca având reactivitate faţă de o proteină solubilă dintr-un lizat omogen de ficat şi pancreas. Ulterior s-a demonstrat  că anti-SLA si anti-LP sunt  identici (anti SLA/LP) şi că antigenul ţintă este reprezentat de o proteină citosolică de 50 kDa ce este implicată în biosinteza seleno-proteinelor (UGA-suppressor serine-tRNA-associated protein). Aceşti anticorpi sunt înalt specifici pentru AIH  având o prevalenţă de 10-30%^1;2;6.

 Anti-LC1 apar in AIH tip II, fiind detectaţi la 50% din serurile LKM  positive. Unii autori  îl asociază cu ANA şi ASMA şi  de asemenea cu  hepatita cronică cu virus C. Ei  recunosc ca antigen ţintă  formiminotransferaza-ciclodeaminaza  şi se corelează cu activitatea bolii^2;6;7.

Alţi  anticorpi care  mai pot apărea în AIH sunt :

• p-ANCA atipici
• anti-LKM3 (ţinta antigenică este reprezentată de de uridin-difosfat glucuronoziltransferaza şi sunt întâlniţi la pacienţi cu hepatită cronică D şi AIH tip II)
• anti-LKM2 (îndreptaţi împotriva CYP2C9 şi asociaţi cu  hepatita  la ticrynafen)
• anti-receptor pentru asialoglicoproteine (ASGP-R, sunt întâlniţi atât la pacienţi cu AIH cât şi cu hepatită virală; se corelează cu activitatea histologică)¹.

Diversitatea serologică  a anticorpilor a condus la ipoteza că AIH reprezintă un grup heterogen de boli. Această ipoteză este susţinută de asocierea  în 10-18 % din cazuri a unui sindrom multiorganic (APECED) caracterizat prin candidiază mucocutanată cronică, distrofie ectodermală şi distrucţie tisulară autoimună a diferitelor glande endocrine (hipoparatiroidism, insuficienţă suprarenaliană, hipogonadism)^1;7.

 Ciroza  biliară primitivă (PBC)  apare în 90% din cazuri la femei de vârstă mijlocie. Incidenţa bolii în diferite regiuni ale lumii este de 4-31 cazuri /1 million locuitori/an. Clinic, pacienţii prezintă fatigabilitate, prurit, artralgii, dureri abdominale, icter obstructiv intermitent. Patognomonici  pentru această afecţiune  sunt anticorpii antimitocondriali (AMA) care  apar la 95% din pacienţi. Ei sunt îndreptaţi asupra subunităţii E2  a complexului piruvat dehidrogenazei (PDC-E2). Acest  antigen  este exprimat  la nivel hepatic,  în jurul ductelor biliare, iar autoanticorpii vor duce la distrucţia canaliculelor biliare cu colestază secundară. Diagnosticul PBC este luat în considerare  dacă:

1. testele  de colestază sunt pozitive (ALP, GGT)
2. AMA sunt   pozitivi
3. examenul histopatologic este sugestiv (colangită cronică non-supurativă  cu distrucţie progresivă  a ductelor  biliare  şi fibroză).

Boala poate afecta atât ficatul cât şi glandele cu funcţie exocrină (glande salivare, lacrimale, pancreas). Titrurile AMA crescute   susţin diagnosticul de PBC şi pot avea  valoare predictivă pentru dezvoltarea  ulterioară de PBC  la pacienţi cu simptome  de  colestază. AMA mai pot fi detectaţi şi în sindroame  overlap PBC-AIH, scleroza sistemică (6%) şi sindromul  Sjögren^1;4;5.

Alţi  autoanticorpi  specifici  PBC sunt:

Anti-gp210    recunosc un antigen de 210 kDa  al membranei  nucleare şi apar la 10-47% din pacienţii cu PBC.

Anti-Sp100 apar  la  20% din pacienţii cu PBC  şi sunt îndreptaţi împotriva   unor structuri  numite corpi nucleari (“nuclear  dots”) care în imunofluorescenţa indirectă prezintă un aspect punctat şi care au fost puşi în evidenţă pentru prima dată în  nucleii celulelor maligne. Aceşti corpi nucleari  ce conţin fibre non-cromatiniene   reprezintă un complex alcătuit din următoarele componente: antigenul sp100, antigenul PML (promyelocytic leukemia factor), LYSP 100, NDP55 şi NDP 53.

Anti-NUP62 (Nucleoporina p62)  apar în  32% din cazurile de PBC.

Mai puţin specifici pentru PBC sunt anticorpii anti receptor lamin B şi anti-ciclină A.

În tabelul de mai jos este menţionată sensibilitatea şi specificitatea diverselor tipuri de autoanticorpi pentru PBC:

	AMA M2	M2-3E	SP100	PML	SP100/PML	GP210	TOTAL
Sensibilitate	81%	86%	21%	13%	24%	26%	94%
Specificitate	100%	100%	100%	100%	100%	100%	99%

 Tratamentul PBC  impune reducerea colestazei şi îmbunătăţirea  funcţiei hepatice; constă în administrarea de acid ursodeoxicolic şi colestiramină. În cazuri severe este indicat transplantul hepatic^1;3;6.

O situaţie aparte este reprezentată de  sindroamele overlap PBC-AIH în care anticorpii AMA  se asociază  cu  cei din AIH (10-20% din cazuri). Aceste sindroame pot coexista de la început (PBC-AIH) sau PBC poate progresa  către AIH. Identificarea sindroamelor overlap este foarte importantă datorită eficacităţii dovedite a tratamentului corticosteroid. Pentru diagnosticul sindroamelor overlap AIH-PBC  au fost elaborate criteriile Paris⁵:

Criterii pentru PBC	Criterii pentru AIH
1. Activitatea fosfatezei alcaline în ser ≥ 2x limita  superioară a normalului sau activitatea GGT în ser ≥ 5x	Activitatea ALT în ser  ≥ 5x limita superioară a normalului
2. AMA pozitivi	Nivelul IgG în ser ≥ 2x limita superioară a normalului sau ASMA pozitivi
3. Biopsie hepatică ce indică leziuni floride    de ducte biliare	Biopsie hepatică ce indică “piecemeal necrosis” moderată/severă periportală sau periseptală
Pentru dg. de sindrom overlap PBC-AIH sunt necesare cel puţin 2 din cele 3 criterii acceptate pentru pentru fiecare condiţie.

Colangita sclerozantă  primitivă (PSC) apare cu o incidenţă de  4 cazuri la 100 000 locuitori/an. Tabloul clinic este dominat de simptomele şi semnele de colestază. Diagnosticul  se bazează pe  modificările testelor de laborator, examenul histologic şi  colangiopancreatografia  endoscopică retrogradă (ERCP). Sunt afectaţi în principal bărbaţii iar în 50% din cazuri se asociază  şi colita ulceroasă. Autoanticorpii identificaţi în această  afecţiune  sunt  p-ANCA cu aspect atipic în imunofluorescenţa indirectă, îndreptaţi impotriva antigenelor: catepsină G, lactoferină, catalază, alfa-enolază. Aceştia  pot apărea  ocazional şi  în AIH  şi  PBC^1;4.

 Recomandări –  pacienţi cu suspiciune clinică de boli hepatice autoimune¹.

 Pregătire pacient – à jeun (pe nemâncate) sau postprandial (după mese)⁷.

 Specimen recoltat – sânge venos⁷.

 Recipient de recoltare – vacutainer fără anticoagulant cu/fără gel separator⁷.

 Prelucrare necesară după recoltare – se separă serul prin centrifugare⁷.

 Volum probă – minim 1 mL ser⁷.

Cauze de respingere a probei:

• specimen hemolizat;
• specimen icteric, lipemic;
• specimen contaminat bacterian⁷.

 Stabilitate probă – serul separat este stabil 14 zile la 2-8ºC şi timp îndelungat la -20ºC. Nu decongelaţi/recongelaţi⁶.

Metodă – imunoblot. Testul utilizează 9 antigene native şi recombinate purificate, care sunt fixate  în cip-uri paralele pe membrana unui strip. Antigenele sunt reprezentate, în ordinea fixării pe strip, de:

– AMA M2: antigen nativ purificat

– M2-3E (BPO): antigen recombinat ce cuprinde domeniile imunogenice ale subunităţiii E2

– Sp100: antigen recombinat

 – PML: antigen recombinat

– GP210: antigen recombinat

– LKM1: antigen recombinat

– LC-1: antigen recombinat

– SLA/LP: antigen recombinat

– Ro 52: antigen recombinat

 Într-o primă etapă strip-ul încărcat cu antigenele purificate este incubat împreună cu serul diluat al pacientului. Dacă în ser sunt prezenţi anticorpi specifici aceştia se vor lega de antigenele corespunzătoare de pe strip. După o etapă de spălare, strip-ul este incubat cu un conjugat anti-IgG uman marcat cu fosfataza alcalină. Conjugatul se va ataşa la porţiunea IgG a complexului antigen-anticorp. După îndepărtarea prin spălare a conjugatului nelegat se adaugă soluţia de colorare (substratul enzimei) – un sistem de detecţie enzimatică colorimetrică . Dacă este prezent conjugatul legat reacţia enzimatică va genera un produs colorat albastru-închis la nivelul benzilor ocupate de anticorpi specifici. Astfel, benzile vizualizate la nivelul stripului sunt rezultatul legării  anticorpilor specifici de antigenele individuale de la nivelul strip-ului.

 Pe fiecare strip  există o bandă de control intern. Apariţia unei reacţii de culoare intense la acest nivel certifică faptul că toate etapele testului imunoblot au fost executate corect⁷.

Valori de referinţă  şi interpretarea rezultatelor

Interpretarea definitivă a rezultatelor testului se face cu ajutorul unui software (după scanarea strip-urilor) care în funcţie de intensitatea semnalului, acordă un punctaj pentru fiecare bandă a strip-ului, astfel:

EVALUARE SEMNAL	INTENSITATE  SEMNAL	REZULTAT
Fără  bandă	0-5	0	NEGATIV
Bandă slabă	6-10	(+)	ECHIVOC
Bandă medie-intensă	11-25 sau 26-50	+,++	POZITIV
Bandă foarte intensă	>50	+++	INTENS POZITIV

În final este calculată suma  punctelor acordate şi se va genera rezultatul testului.

 Un rezultat pozitiv confirmă prezenţa anticorpilor specifici .

 Un rezultat echivoc indică faptul că prezenţa auto- anticorpilor  este incertă; în funcţie de contextul clinic al pacientului testul va fi repetat la un interval de 1-2 luni.

 Un rezultat negativ indică absenţa auto-anticorpilor specifici.

 Valori de referinţă

 Anti-AMA M2: negativ

 Anti-M2-3E: negativ

 Anti-sp100: negativ

 Anti-PML: negativ

 Anti-gpP210: negativ

 Anti-LKM 1: negativ

 Anti-LC1: negativ

 Anti-SLA/LP: negativ

 Anti-Ro 52: negativ⁷.

Bibliografie

1.  A. J. Czaja. Autoantibodies as prognostic markers in autoimmune liver disease. In  Digestive Diseases and Sciences, vol. 55,  no. 8, pp. 2144–2161, 2010.
2. Ashima Makol et al. Autoimmune Hepatitis: A Review of Current Diagnosis and Treatment. In Hepatitis Research and Treatment, volume 2011 (2011).
3. Christian P. Strassburg. Autoantibodies and Autoantigens in Autoimmune Hepatitis. In Semin Liver Dis. 2002 Nov;22(4):339-52.
4. D.P. Bogdanos. Autoimmune liver serology: current diagnostic and clinical challenges. In World Journal of Gastroenterology, 2008, 14(21):3374-87.
5. Edith Kuiper. Primary billiary cirrhosis: Diagnostic and Therapeutic Aspects. Erasmus University Medical Centre Rotterdam.
6. Kalliopi Zachou, et al. Autoantibodies and autoantigens in autoimmune hepatitis: important tools in clinical practice. In Journal of Autoimmune Diseases, 2004, 2: 1740-1757.
7. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2012. Ref Type: Catalog.