Profil anticorpi antineuronali-Blot (Amfifizină, CV2, PNMA2 (Ma2/Ta), Ri, Yo, Hu, Recoverin, SOX1)

Laborator Synevo

 

Informatii generale si recomandari pentru determinarea anticorpilor anti-neuronali

Anticorpii anti-neuronali reprezinta o categorie speciala de autoanticorpi ce asociaza cu sindroamele neurologice paraneoplazice.

Sindroamele neurologice paraneoplazice (paraneoplastic neurological syndromes, PNSs) sunt definite ca sindroame clinice neurologice care acompaniaza tumorile maligne, dar care nu sunt determinate de acestea sau de metastazele lor, nu au origine vasculara sau infectioasa si nu constituie efecte adverse ale medicatiei. Aceste sindroame au la baza mecanisme imunologice al caror efect se manifesta la distanta de tumora primara si/sau site-ul metastatic¹.

In literatura  sunt utilizate doua tipuri de nomenclaturi pentru anticorpii antineuronali: una dintre acestea este bazata pe primele 2 litere ale pacientului la care a fost descris  prima data anticorpul respectiv (Hu de la Hull, Yo de la Young, Ma de la Margret), iar cealalta pe initialele coloratiei imunohistochimice (ANNA = anticorpi antinucleari antineuronali)².

In functie de tipul tumorii celulele tumorale exprima antigene care induc formarea de autoanticorpi specifici. Acesti autoanticorpi reactioneaza incrucisat cu antigene identice localizate la nivelul tesutului nervos si sunt probabil implicati in dezvoltarea  sindroamelor paraneoplazice¹.

Din momentul in care au fost descrisi pentru prima data anticorpii anti-Hu (1985) este bine cunoscut faptul ca  mai mult de 2/3 din  pacientii cu sindroame paraneoplazice  prezinta in ser autoanticorpi  specifici. Reactiile  antigen-anticorp nu numai ca demonstreaza etiologia paraneoplazica in aproape 100% din cazuri, dar sunt de asemenea strans asociate cu tumori specifice, care pana atunci nu au fost detectate la acesti pacienti³. Astfel, depistarea anticorpilor anti-neuronali poate fi foarte utila in diagnosticul precoce al tumorilor².

PNS  apar in aproximativ 15% din afectiunile neoplazice, in particular  in  tumorile pulmonare si gastrice. Sindroamele  paraneoplazice oto-neuro-oftalmologice rezulta de obicei din encefalita de trunchi cerebral  si/sau degenerescenta cerebeloasa. Acestea se pot dezvolta ca urmare a raspunsului imun fata de proteine onconeurale (ca de exemplu, anti-Hu, anti-Yo, anti-Ri) sau alte antigene necunoscute.

PNS apar cel mai adesea asociate cu carcinomul  pulmonar cu celule mici (SCLC), carcinomul mamar sau ovarian. Sindromul  miastenic Lambert-Eaton (LEMS), unul din cele mai frecvente PNS, prezinta cea mai mare valoare predictiva in ceea ce priveste existenta unei tumori de baza (in acest caz SCLC). In majoritatea PNS,  in special encefalita limbica paraneoplazica (PLE), degenerescenta cerebeloasa paraneoplazica (PCD), sindromul opsoclonus-mioclonus-ataxie (POMA), sindromul „stiff man” (SPS) si retinopatia paraneoplazica (amauroza subacuta), detectia anticorpilor specifici are valoare predictiva pozitiva crescuta, corelandu-se mai bine cu prezenta tumorii de baza decat simptomele clinice propriu-zise^4;5.

Spre exemplu, PCD  este determinata  de mecanismele autoimune care apar in unele neoplazii, mai ales in stadiile precoce ale carcinoamelor mamare, ovariene, pulmonare precum si in limfomul Hodgkin. Reactia imuna indreptata impotriva antigenelor tumorale, identice  cu antigenele  cerebeloase, duce la formarea de anticorpi anti-Hu, anti-Yo, anti-Ri ce pot fi detectati atat in sange cat si in lichidul cefalorahidian. Asocierea existenta intre afectiunea neoplazica si modificarile cerebeloase este demonstrata prin reactia de imunofluorescenta indirecta  in care anticorpii  anti-Yo reactioneaza atat cu celulele Purkinje cerebeloase cat si cu celulele carcinomatoase².

PNS nu numai ca acompaniaza tumorile maligne dar pot  fi intalnite si in afectiuni  autoimune ca diabetul zaharat tip 1 cand se poate demonstra aparitia in paralel  a anticorpilor specifici  anti-substanta cenusie   si a  celor indreptati impotriva celulelor insulare pancreatice. Astfel, detectarea autoanticorpilor fata de enzima glutamat-decarboxilaza (GAD) este importanta atat pentru depistarea precoce a diabetului zaharat tip 1 cat si pentru diagnosticul unor afectiuni neurologice, cum ar fi sindromul „stiff man” asociat cu limfomul Hodgkin⁶.

Conform  recomandarilor Societatii  Germane de Neurologie, determinarea anticorpilor din sindroamele paraneoplazice (anticorpi antineuronali) ar trebui efectuata  utilizand  cel putin doua metode: screening prin  imunofluorescenta indirecta si confirmare  prin tehnica imunoblot. Rezultatele obtinute au relevanta diagnostica numai daca sunt concordante prin cele doua metode si se integreaza in tabloul clinic al pacientilor^8;9.

In tabelul de mai jos sunt prezentati principalii anticorpi indreptati impotriva antigenelor neuronale intracelulare impreuna cu afectiunile neurologice asociate si cu posibilele tumori asociate^4;10:

Autoanticorp (Sinonime)	Antigen (masa moleculara) localizare (L)	Boli neurologice asociate Cele mai frecvente sindroame (SF) Alte sindroame (AS)	Tumori asociate Cele mai frecvente tumori (TF) Alte tumori (AT)
Anti-Hu (ANNA-1, anticorpi antinucleari anti-neuronali tip1)	Proteina Hu, proteina neuronala specifica de legare a ARN-ului, (38 kDa) L: nucleii neuronilor din sistemul nervos central si periferic	SF: encefalite ce afecteaza in special trunchiul cerebral, cerebelul si sistemul limbic; mielite; polineuropatii (autonome, senzitive si senzitivo-motorii) AS: PCD, sindroame motorii  extrapiramidale, LEMS, epilepsie focala, POMA, pseudo-obstructie  gastrointestinala cronica, retinopatie	TF: SCLC, neuroblastom AT: carcinom prostatic, carcinom de vezica urinara, ovarian, mamar, pancreatic, tumori  gastrointestinale maligne
Anti-Ri (ANNA-2, anticorpi antinucleari anti-neuronali tip 2)	NOVA, Ri/NOVA1,  proteine de legare a ARN-ului (55 kDa si 80 kDa) L: nucleii neuronilor din sistemul nervos central	SF: POMA AS: PCD, rombencefalita	TF: SCLC, carcinom mamar AT: limfom Hodgkin si non-Hodgkin, tumora de trunchi cerebral cu proliferare rapida, carcinom ovarian
Anti-Yo (PCA-1, anticorpi tip 1 fata de celula Purkinje)	CDR2, CDR62, antigenul Yo, proteinele de transductie a semnal (34 kDa si 62 kDa) L: Citoplasma (reticul endoplasmatic rugos, aparat Golgi, membrana citoplasmatica) celulelor Purkinje din cerebel	SF: PCD AS: POMA	TF: carcinom uterin, ovarian, mamar AT: adenocarcinom esofagian, carcinom al vezicii biliare, carcinom prostatic, limfom Hodgkin si non-Hodgkin, timom
Anti- CV-2 (Anti-CRMP5)	CV2/CRMP5 (proteina de 66 kDa) L: citoplasma oligodendrocitelor	SF: encefalita limbica AS: PCD, polineuropatii (autonome, senzitive si senzitivo-motorii), retinopatie, uveita, sindrom miastenic, pseudo-obstructie gastrointestinala cronica, coree, POMA, rombencefalita, epilepsie focala	TF: SCLC , timom AT: sarcom uterin
Anti-PNMA2 (Ma2/Ta)	Proteina Ma (40 kDa) L: nucleolii neuronali	SF: rombencefalita, PLE, encefalopatie de trunchi cerebral AS: POMA, PCD, epilepsie focala, sindroam motorii extrapiramidale, retinopatie	TF: seminom testicular AT: carcinom pulmonar altul decat cel cu celule mici, parotidian, mamar, ovarian, de colon, renal, limfom
Anti-amfifizina	Amfifizina (proteina de 128 kDa) L: membrana veziculelor sinaptice Rol in endocitoza veziculelor	SF: SPS AS: sindrom miastenic, polineuropatii (autonome, senzitive si senzitivo-motorii), encefalomielita cu rigiditate, ataxie cerebeloasa, POMA	TF: carcinom mamar, SCLC AT: timom, limfom Hodgkin, carcinom de colon
Anti-PNMA-1 (Ma1)	Proteina Ma (37 kDa)	SF: rombencefalita, (trunchi cerebral) encefalita limbica	TF: carcinom mamar AT: tumori diverse
Anti-GAD	Decarboxilaza acidului glutamic (65kDa si 67kDa)	SF: SPS	TF: SCLC, carcinom mamar, carcinom de colon
PCA-2	Proteina  din celulele Purkinje (280 kDa)	SF: encefalite, neuropatii	TF: SCLC
Anticorpi antinucleari anti-gliali (AGNA)	Proteina SOX1 ce leaga ADN-ul cu rol in activarea transcriptiei L: nuclei celulelor gliale Bergmann din stratul celulelor Purkinje al cerebelului	SF: LEMS, PCD	TF: SCLC
Anti-recoverin	Recoverin (23kDa si 65KDa) – proteina care leaga Ca2+ la nivelul retinei cu functie de reglare a fototransductiei) L: fotoreceptorii retinei	SF: retinopatie	TF: SCLC
Anti-titin	Titin (proteina filamentoasa a muschiului striat)	SF: miastenia gravis	TF: timom
Anti-Tr (PCA-Tr)	necunoscut	FS: PCD	TF: limfom Hodgkin

Pregatire pacient – à jeun (pe nemancate) sau postprandial (dupa mese)⁹.

Specimen recoltat – sange venos⁹.

Recipient de recoltare – vacutainer fara anticoagulant cu/fara gel separator⁹.

Prelucrare necesara dupa recoltare – se separa serul prin centrifugare⁹.

Volum proba – minim 0.5 mL ser⁹.

Cauze de respingere a probei – ser intens hemolizat, lipemic sau puternic contaminat bacterian⁹.

Stabilitate proba – serul separat este stabil 14 zile la 4°C; timp mai indelungat la -20 °C⁹.

Metoda – imunoblot. Testul utilizeaza 9 antigene care sunt fixate  in cip-uri paralele pe membrana unui strip. Antigenele sunt reprezentate, in ordinea fixarii pe strip, de:

–Amfifizina

–CV2

–PNMA2 (Ma2/Ta)

–Ri

–Yo

–Hu

–Recoverin

–SOX1

–Titin

Intr-o prima etapa strip-ul incarcat cu antigenele purificate este incubat impreuna cu serul diluat al pacientului. Daca in ser sunt prezenti anticorpi specifici acestia se vor lega de antigenele corespunzatoare de pe strip. Dupa o etapa de spalare, strip-ul este incubat cu un conjugat anti-IgG uman marcat cu fosfataza alcalina. Conjugatul se va atasa la portiunea IgG a complexului antigen-anticorp. Dupa indepartarea prin spalare a conjugatului nelegat se adauga solutia de colorare (substratul enzimei) – un sistem de detectie enzimatica colorimetrica . Daca este prezent conjugatul legat reactia enzimatica va genera un produs colorat albastru-inchis la nivelul benzilor ocupate de anticorpi specifici. Astfel, benzile vizualizate la nivelul stripului sunt rezultatul legarii  anticorpilor specifici de antigenele individuale de la nivelul strip-ului.

Pe fiecare strip  exista o banda de control intern. Aparitia unei reactii de culoare intense la acest nivel certifica faptul ca toate etapele testului imunoblot au fost executate corect⁹.

Valori de referinta  si interpretarea rezultatelor

Interpretarea definitiva a rezultatelor testului se face cu ajutorul unui software (dupa scanarea strip-urilor) care in functie de intensitatea semnalului, acorda un punctaj pentru fiecare banda a strip-ului, astfel:

EVALUARE SEMNAL	INTENSITATE  SEMNAL	REZULTAT
Fara  banda	0-5	0	NEGATIV
Banda slaba	6-10	(+)	ECHIVOC
Banda medie-intensa	11-25 sau 26-50	+,++	POZITIV
Banda foarte intensa	>50	+++	INTENS POZITIV

In final este calculata suma  punctelor acordate si se va genera rezultatul testului.

Un rezultat pozitiv confirma prezenta anticorpilor specifici.

Un rezultat echivoc indica faptul ca prezenta auto- anticorpilor  este incerta; in functie de contextul clinic al pacientului testul va fi repetat la un interval de 1-2 luni.

Un rezultat negativ indica absenta auto-anticorpilor specifici⁹.

Valori de referinta⁹

–Amfifizina: negativ.

–CV2: negativ.

–PNMA2 (Ma2/Ta): negativ

–Ri: negativ

–Yo: negativ

–Hu: negativ

–Recoverin: negativ

–SOX1: negativ

–Titin: negativ.

Bibliografie

1. Graus F, Saiz A, Dalmau J. Antibodies and neuronal autoimmune disorders of the CNS. In J Neurol 257 (2010) 509-517.
2. Dalmau J, Rosenfeld MR. Paraneoplastic syndromes of the CNS. In Lancet Neurol 7 (2008) 327-340.
3. Darnell RB, Posner JB. Paraneoplastic syndromes affecting the nervous system. In Semin Oncol 33 (2006) 270-298.
4. Roceanu A, Bajenaru O. Sindroamele paraneoplazice in practica neurologica. Articol preluat din Revista Romana de Neurologie pentru sectunea EMC Neurologie, iulie 2008. Ref Type: Internet Communication.
5. Dalmau J, Porta-Etessam J. Paraneoplastic cerebral syndromes with oto-neuroophthalomologic manifestations. In Rev Neurol 31 (2000) 1213-1219.
6. Graus F, Saiz A, Dalmau J. Antibodies and neuronal autoimmune disorders of the CNS. In J Neurol 257 (2010) 509-517.
7. Graus F, Delattre JY, Antoine JC, Dalmau J, Giometto B, Grisold W, Honnorat J, Smitt PS, Vedeler C, Verschuuren J, Vincent A, Voltz R for the Paraneoplastic Neurological Syndrome Euronetwork (2004). Recommended diagnostic criteria for paraneoplastic neurological syndromes. JNNP 75 (2004) 1135-1140.
8. Diener HC (Hrsg.) Leitlinien für Diagnostik und Therapie in der Neurologie. 3. überarbeitete Auflage 2005, Georg Thieme Verlag Stuttgart.
9. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2013. Ref Type: Catalog.
10. Lorusso L, Hart IK, Giometto B, Pezzani R, Broome JC, Gritti D, Gasparetto C, Ricevuti G. Immunological features of neurological paraneoplastic syndromes. Int J Immunopathol Pharmacol 17 (2004) 135-144.