Laborator Synevo
Informaţii generale
Bolile autoimune sistemice se caracterizează prin prezenţa în titruri crescute a autoanticorpilor faţă de proteine intracelulare şi acizi nucleici. Aceşti autoanticorpi sunt denumiţi generic anticorpi antinucleari (ANA) datorită faptului sunt îndreptaţi predominant împotriva antigenelor nucleare, dar ei includ şi anticorpi anticitoplasmatici.
Detectarea ANA are o mare sensibilitate, de aceea este considerat cel mai bun test de screening pentru bolile reumatice sistemice. Prevalenţa ANA în aceste afecţiuni se situează între 20 şi 100%. Pentru identificarea bolilor reumatismale este foarte importantă diferenţierea ANA1;7;8. Astfel, sunt descrise în prezent două categorii principale de anticorpi antinucleari:
- Autoanticorpi ce au drept ţintă antigenică ADN-ul şi histonele;
- Autoanticorpi ce au drept ţintă antigene nucleare solubile (extractable nuclear antigens = ENA).
Varietatea autoantigenelor ţintă ale anticorpilor anti-nucleari este extrem de mare de aceea în prezenţa unui rezultat pozitiv la examenul prin imunofluorescenţă indirectă este necesară detectarea de anticorpi specifici care să orienteze diagnosticul către o anumită boală autoimună. Utilizarea tehnicii imunoblot prezintă avantajul testării unor profile extinse de autoanticorpi, cum este şi cazul celui efectuat în laboratorul nostru care permite diferenţierea ANA faţă de 15 antigene9.
Anticorpii anti-U1nRNP şi Sm sunt indreptaţi împotriva unor antigene care aparţin grupului de ribonucleoproteine mici (snRNP). Acestea sunt complexe formate din ARN cu un conţinut înalt de uridină (U-RNA) şi diverse proteine având o greutate moleculară de 9-70 kDa. Prin cromatografie au fost puse în evidenţă 5 tipuri de U-RNA: U1, U2, U4, U5 şi U6. Particulele de U-nRNP conţin 6 proteine core sau Sm (B, B’, D, E, F, G), iar U1-RNP conţine în plus proteine specifice (70K, A, C). Astfel, anticorpii anti – U1 RNP reacţionează cu una sau mai multe proteine specifice în timp ce anticorpii anti-Sm reacţionează cu una sau mai multe proteine core. Acţiunea snRNP este esenţială pentru eliminarea intronilor din pre-ARN-ul mesager (procesul de splicing ), rezultând ARNm care va fi exportat din nucleu şi implicat in procesul de translaţie a proteinelor de la nivelul ribozomilor.
Titruri crescute de anticorpi anti-U1 RNP se întâlnesc cu o prevalenţă de 95-100% în boala mixtă de ţesut conjunctiv (sindromul Sharp), constituind unul din criteriile de diagnostic al acestei afecţiuni. Titrul de anticorpi se corelează de asemenea cu gradul de activitate a bolii. Anticorpii anti-U1 RNP mai pot fi întâlniţi şi la pacienti cu LES (15-40%), scleroză sistemică şi polimiozită1;4.
Anticorpii anti-Sm sunt îndreptaţi asupra antigenului Sm, denumit astfel după primul pacient (Stephanie Smith) la care a fost pus în evidenţă. Antigenul Sm face parte din grupul snRNP implicate în procesul de splicing al ARN-ului mesager. Anticorpii anti-Sm sunt întâlniţi la 5-40% din pacienţii cu LES având o specificitate înaltă (peste 90%) pentru boala lupică. Împreună cu anticorpii anti-ADN dublu catenari pot fi consideraţi patognomonici pentru această condiţie clinică şi fac parte din criteriile ACR de diagnostic al LES6.
Anticorpii anti-SS-A (Ro)sunt îndreptaţi împotriva unui antigen care face parte tot din grupul ribonucleoproteinelor mici (soluble substance A sau Robert antigen). Acesta este compus dintr-o moleculă ARN (Y1, Y2, Y3, Y4 sau Y5) şi o proteină de 60 kDa. Complexul poate asocia şi o proteină de 52 kDa (Ro52) ,dar acest lucru este încă controversat în literatura de specialitate. Diverse studii au arătat că serurile pozitive pentru SS-A conţin întotdeauna anticorpi împotriva proteinei native SS-A de 60 kDa şi adiţional pot avea şi anticorpi îndreptaţi împotriva proteinei Ro52. Diferenţierea de anticorpii anti-Ro52 are importanţă diagnostică, deoarece aceştia sunt nespecifici, putând fi detectaţi într-o multitudine de afecţiuni.
Anticorpii anti-SS-A sunt asociaţi cu diverse boli autoimune: Sindrom Sjögren (40-95% din cazuri), LES (20-60%), ciroză biliară primitivă (20%). Trebuie menţionat că aceşti autoanticorpi apar în 100% din cazurile de lupus neonatal. Pot fi întâlniţi de asemenea în hepatitele autoimune sau virale.
Anticorpii anti-SS-B (La) sunt îndreptaţi împotriva unei proteine ce deţine un rol în transcripţia ARN polimerazei III (soluble substance B sau Lane antigen). La reprezintă probabil un factor de finalizare a transcripţiei care se leagă de capătul 3′ al produşilor de transcripţie nou-generaţi ai ARN polimerazei III. Anticorpii anti-SS-B apar de obicei împreună cu anti-SS-A, fiind asociaţi cu aceleaşi condiţii clinice1;8;9.
Anti-Ro52 sunt îndreptaţi împotriva unui antigen de 52 kDa şi au fost descrişi ca autoanticorpi nespecifici asociaţi atât cu boli reumatice cât şi non-reumatice. Sunt prezenţi într-un procent de 100% la mamele feţilor sau nou-născuţilor cu bloc atrio-ventricular congenital sau lupus neonatal1.
Anticorpii anti-Scl-70 sunt îndreptaţi împotriva unei proteine non-histonice de 70 kDa, izolată iniţial din nuclei de celule hepatice provenite de la şobolan. Ulterior, s-a demonstrat că această proteină este un produs de degradare al ADN topoizomerazei I, o clasă de enzime localizate în nucleoplasmă şi nucleoli, având funcţia de a menţine integritatea informaţională a ADN (prin capacitatea de a scinda şi de a reuni la loc unul din cele două lanţuri ADN).
Anticorpii anti-Scl-70 se găsesc la 40% din pacienţii cu scleroză sistemică forma difuză şi la 10% din pacienţii cu scleroză sistemică forma limitată, fiind un element de prognostic nefavorabil1;4;8;9.
Anticorpii anti PM-Scl sunt îndreptaţi împotriva proteinelor complexului nucleolar PM-Scl, compus din 11-16 polipeptide în care componentele antigenice au greutăţi moleculare cuprinse între 20 kDa şi 110 kDa. Principalele antigene sunt 2 polipeptide de 75 şi respectiv 100 kDa, cunoscute ca PM-Scl 75 şi PM-Scl 100. Cele 2 antigene sunt independente unul de celălat şi nu reacţionează încrucişat. Acest complex de proteine este implicat în biosinteza ribozomilor. Anticorpii anti-PM-Scl se asociază frecvent cu sindroamele overlap sclerodermie-polimiozită/dermatomiozită.
Anticorpii anti-Jo-1 sunt îndreptaţi împotriva enzimei histidil-t-ARN sintetaza. In vitro aceşti autoanticorpi se leagă de epitopii conformaţionali ai enzimei şi îi inhibă activitatea catalitică. Antigenul este sub formă dimerică şi este localizat în citoplasmă; masa moleculară a subunităţilor este 50 kDa. Anticorpii anti-Jo-1 constituie un marker serologic pentru dermatomiozită/polimiozită, având o prevalenţă de 20-40%. Prezenţa acestor autoanticorpi se asociază cu o formă mai severă de boală, cu un prognostic rezervat şi recăderi mai frecvente. Autoanticorpii pot fi detectaţi precoce, uneori precedând debutul simptomelor.
Anticorpii anti-CENP B sunt îndreptaţi împotriva unei proteine de 80 kDa localizată în zona de ancorare a fibrelor fusului mitotic în cursul mitozei. Toate serurile care conţin anticorpi anti-centromer reacţionează cu CENP-B. Anticorpii anti-CENP B constituie un marker serologic pentru sindromul CREST, un subtip de scleroză sistemică (prevalenţă 70-90%). Pot apărea şi la pacienţii cu ciroză biliară primitivă.
Anticorpii anti-PCNA(proliferating cell nuclear antigen) sunt îndreptaţi împotriva unei proteine de 36 kDa ce constituie un cofactor al ADN polimerazei şi participă astfel la procesul de replicare şi reparare a ADN-ului. Acest antigen se mai numeşte şi ciclina I, având un rol şi în reglarea ciclului celular. Aspectul în imunofluorescenţa indirectă este variabil (granular/pătat), jumătate din nucleii celulelor în interfază având o intensitate scăzută. Anti-PCNA sunt detectaţi la 3% din pacientii cu SLE1;9.
Anticorpii anti-ADN dublu catenar reacţionează cu principalii epitopi ai acidului dezoxiribonucleic (ADN) nativ, dublu spiralat. Aceşti anticorpi reprezintă un marker de înaltă specificitate pentru LES, fiind prezenţi la aproximativ 60% (30-90%) dintre pacienţii cu boală lupică. Constituie de asemenea un instrument de monitorizare a evoluţiei clinice a acestei boli, deoarece nivelele serice de anticorpi anti-ADN se corelează cu gradul de activitate a bolii (în special pentru nefrita lupică). Se mai pot asocia într-un procent redus cu lupusul indus medicamentos, artrita reumatoidă şi scleroza sistemică1;5.
Anticorpii anti-nucleozomi
Nucleoproteinele (cromatina) sunt compuse din 40% ADN, 40% histone şi 20% proteine non-histonice. Histonele sunt organizate de-a lungul ADN-ului în unităţi repetitive numite nucleozomi. Fiecare nucleozom este alcătuit dintr-un miez ce conţine 8 histone (2 din clasa H2A, 2 H2B, 2 H3 şi 2 H4) şi este înfăşurat prin 2 rotaţii complete de o secvenţă ADN (165bp). Nucleozomii sunt legaţi între ei printr-un segment de ADN liber având forma unui şirag de mărgele. Această structură, menţinută strîns de histona H1 ce leagă 2 nucleozomi vecini, realizează o împachetare a ADN-ului de 10 ori. Anticorpii anti-nucleozomi reacţionează cu partea expusă, adică cu ADN-ul din cromatină. Studiile clinice au demonstrat că aceşti anticorpi apar înaintea anticorpilor anti-ADN dublu catenar la pacienţii cu LES2.
Anticorpii anti-histone reacţionează împotriva histonelor ce constituie împreună cu ADN-ul componentele esenţiale ale cromatinei nucleare. Histonele sunt alcătuite din proteine bogate în aminoacizii arginină şi lizină, iar una din funcţiile lor importante este implicarea în organizarea structurală a cromatinei în nucleozomi .
Toate cele cinci clase de histone (H1, H2A, H2B, H3, H4) ca şi complexele ADN-histone pot fi ţintă pentru producerea de autoanticorpi. Anticorpii antihistone apar la aproximativ 95% dintre pacienţii cu lupus eritematos indus medicamentos şi reprezintă cel mai important criteriu de diagnostic. Cele mai frecvente medicamente implicate în apariţia lupusului medicamentos sunt: procainamida, hidralazina, isoniazida, carbamazepina, penicilamina, clorpromazina, alfa metildopa, chinidina, salazosulfapiridina, minociclina. Anticorpii anti-histone pot persista ani după întreruperea medicamentului incriminat.
Anticorpii anti-histone pot să apară şi în alte afecţiuni, cum ar fi LES şi artrita reumatoidă1;2;8.
Anticorpii anti-proteina P ribozomală sunt îndreptaţi împotriva a 3 fosfoproteine ribozomale: P0 (38 kDa), P1 (19 kDa) şi P2 (17kDa). Aceşti anticorpi prezintă un patern citoplasmatic în imunofluorescenţa indirectă şi constituie un marker pentru afectarea neuro-psihică în LES; nu se corelează cu activitatea bolii9.
Anticorpi anti-mitocondriali AMA M2 sunt îndreptaţi asupra subunităţii E2 a complexului piruvat dehidrogenazei (PDC-E2). Titrurile crescute vin în sprijinul diagnosticului de ciroză biliară primitivă (PBC) şi pot avea valoare predictivă pentru dezvoltarea ulterioară de PBC la pacienţi cu semne de colestază. Anti-M2 mai pot fi detectaţi în sindroame overlap ciroză biliară primitivă – hepatită autoimună (PBC-AIH), scleroza sistemică (6%) şi sindromul Sjögren1;3;4.
Recomandări pentru determinarea profilului ANA extins – BLOT – evaluarea pacienţilor cu testul ANA IIF (imunofluorescenţă indirectă) pozitiv şi cu semne clinice sugestive de afecţiune reumatismală sistemică. În general nu se recomandă efectuarea ENA în prezenţa unui rezultat ANA IIF negativ decât dacă pacientul are semne clinice evidente de boală reumatismală şi în special de sindrom Sjögren testul ANA poate fi uneori negativ în prezenţa unor anticorpi faţă de antigene foarte solubile, cum ar fi SS-A/Ro sau faţă de antigene citoplasmatice exprimate insuficient pe preparatele Hep-2 sau alte ţesuturi, cum ar fi Jo-1)7.
Pregătire pacient – à jeun (pe nemâncate) sau postprandial (după mese)1.
Specimen recoltat – sânge venos1.
Recipient de recoltare – vacutainer fără anticoagulant cu/fără gel separator1.
Prelucrare necesară după recoltare – se separă serul prin centrifugare1.
Volum probă – minim 0.5 mL ser1.
Cauze de respingere a probei – ser intens hemolizat, lipemic sau puternic contaminat bacterian1.
Stabilitate probă – serul separat este stabil 14 zile la 4°C; timp mai îndelungat la -20 °C2.
Metodă – imunoblot. Testul utilizează 15 antigene native si recombinate purificate, care sunt fixate in cip-uri paralele pe membrana unui strip. Antigenele sunt reprezentate, în ordinea fixării pe strip, de:
– nRNP/Sm: antigen nativ purificat
– Sm: antigen nativ purificat
– SS-A: antigen nativ purificat
– Ro 52: antigen recombinant
– SS-B: antigen nativ purificat
– Scl-70:antigen nativ purificat
– PM/Scl: antigen recombinat
– Jo-1: antigen nativ purificat
– CENP B:antigen recombinat
– PCNA:antigen recombinat
– ds DNA: antigen nativ purificat
– nucleozomi: antigen nativ
– histone: antigen nativ
– proteina P-ribozomala: antigen nativ
– AMA-M2: antigen nativ
Într-o primă etapă strip-ul încărcat cu antigenele purificate este incubat împreună cu serul diluat al pacientului. Dacă în ser sunt prezenţi anticorpi specifici aceştia se vor lega de antigenele corespunzătoare de pe strip. După o etapă de spălare, strip-ul este incubat cu un conjugat anti-IgG uman marcat cu fosfataza alcalină. Conjugatul se va ataşa la porţiunea IgG a complexului antigen-anticorp. După îndepărtarea prin spălare a conjugatului nelegat se adaugă soluţia de colorare (substratul enzimei) – un sistem de detecţie enzimatică colorimetrică . Dacă este prezent conjugatul legat reacţia enzimatică va genera un produs colorat albastru-închis la nivelul benzilor ocupate de anticorpi specifici. Astfel, benzile vizualizate la nivelul stripului sunt rezultatul legării anticorpilor specifici de antigenele individuale de la nivelul strip-ului.
Pe fiecare strip există o bandă de control intern. Apariţia unei reacţii de culoare intense la acest nivel certifică faptul că toate etapele testului imunoblot au fost executate corect.
Valori de referinţă şi interpretarea rezultatelor
Interpretarea definitivă a rezultatelor testului se face cu ajutorul unui software (după scanarea strip-urilor) care în funcţie de intensitatea semnalului, acordă un punctaj pentru fiecare bandă a strip-ului, astfel:
|
EVALUARE SEMNAL |
INTENSITATE SEMNAL |
REZULTAT |
|
|
Fără bandă |
0-5 |
0 |
NEGATIV |
|
Bandă slabă |
6-10 |
(+) |
ECHIVOC |
|
Bandă medie-intensă |
11-25 sau 26-50 |
+,++ |
POZITIV |
|
Bandă foarte intensă |
>50 |
+++ |
PUTERNIC POZITIV |
În final este calculată suma punctelor acordate şi se va genera rezultatul testului.
Un rezultat pozitiv confirmă prezenţa anticorpilor specifici .
Un rezultat echivoc indică faptul că prezenţa auto- anticorpilor este incertă; în funcţie de contextul clinic al pacientului testul va fi repetat la un interval de 1-2 luni.
Un rezultat negativ indică absenţa auto-anticorpilor specifici.
Valori de referinţă:
– nRNP/Sm: negativ
– Sm: negativ
– SS-A: negativ
– Ro 52: negativ
– SS-B: negativ
– Scl-70: negativ
– PM/Scl: negativ
– Jo-1: negativ
– CENP B: negativ
– PCNA: negativ
– ds DNA: negativ
– nucleozomi: negativ
– histone: negativ
– proteina P-ribozomala: negativ
– AMA-M2: negativ3.
Bibliografie
- Carlos Alberto von Mühlen, Robert M. Nakamura. Clinical and laboratory Evaluation of Systemic Rheumatic Diseases. In Henry´s Clinical Diagnosis and Management By Laboratory Methods, Ed.Saunders, 2007, 924-928.
- EUROIMUN AG. Schlumberger W, et al. Diagnostic relevance of autoantibodies against nucleosomes. In Autoimmunity Reviews (2002), 32.
- Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2012. Ref Type: Catalog.
- Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Antinuclear Antibodies. www.labcorp.com 2012. Ref Type: Internet Communication.
- Haugbro K, et al. Anti-dsDNA antibodies and disease classification in antinuclear antibody positive patients: the role of analytical diversity. In Ann Rheum Dis 63 (2004), 386-394.
- Soto ME, et al. Gender impact in systemic lupus erythematosus. In Clin Exp Rheumatol 22 (2004), 713-721.
- Tozzoli et al. Guidelines for the Laboratory Use of Autoantibody Tests in the Diagnosis and Monitoring of Autoimmune Rheumatic Diiseases. InAm Clin J Pathol 2002, 117, 316-324.
- van Venrooji WJ et al. The consensus workshop for the detection of autoantibodies to intracellular antigens in rheumatic diseases. In J Immunol Methods 5 (1991), 181-189.
- Yashwant Kumar et al. Antinuclear antibodies and their detection methods in diagnosis of connective tissue diseases: a journey revisited. InDiagnostic Pathology, 2009, 4:1.