Legionella pneumophila

Laborator Synevo

 

Informatii generale

Din genul Legionella fac parte bacili Gram-negativi mici, subtiri, aerobi, nesporulati, mobili prin unul sau mai multi flageli polari³. In cadrul genului sunt descrise pana in prezent 45 specii, dintre care Legionella pneumophila este cea mai importanta specie patogena pentru om¹.

Legionelele sunt foarte larg raspandite in natura mai ales in medii apoase (lacuri, rauri, soluri umede) si sunt capabile sa supravietuiasca in conditii foarte variate (conducte de aer conditionat si turnuri de racire a apei potabile, reteaua instalatiilor de apa calda, umidificatoare de aer, bazine de scurgere, echipamente tehnico-medicale din spitale). Speciile de Legionella pot sa infecteze si sa se multiplice in unele specii de amoebe (Hartmannella, Acanthamoeba si Naegleria spp.), protozoare (Tetrahymena) precum si in interiorul biofilmelor (microcolonii bacteriene din canalele de apa). Aceasta proprietate contribuie la supravietuirea legionelelor in mediu^1;3. In plus, Legionella pneumophila exista sub doua forme distincte in celulele Hela:

          – o forma asemanatoare chistului, aflata intr-o stare metabolica dormanta, cu un potential infectant ridicat si rezistenta la  antibiotice si detergenti ;

          – o forma intracelulara replicativa, asemanatoare bacteriilor crescute pe agar¹.

Denumirea de Legionella provine de la prima epidemie de pneumonie severa, cu un numar mare de decese, care s-a produs printre participantii la Conventia Anuala din 1976 a Legiunii Americane a fostilor combatanti care s-a desfasurat la Philadelphia. Bacteriile care au determinat aceasta epidemie au fost izolate in 1977 si denumite Legionella pneumophila, iar boala a intrat in patologie ca legioneloza sau boala legionarilor³.

Infectiile induse de Legionella sunt dobandite exclusiv din surse exterioare, legate de mediu; nu au fost descrise cazuri de transmitere prin contact interuman. Principala modalitate de transmitere a infectiei este inhalarea de aerosoli de apa contaminata, atat la locurile de munca, cat si in spitale^1;3;4.

Infectiile cu Legionella pot imbraca forme clinice variate: de la cazuri asimptomatice pana la forme severe de boala, pulmonare sau extrapulmonare, uneori letale. Pot fi afectate atat  persoane normale cat si cele debilitate sau imunodeprimate (varstnici, mari fumatori, persoane spitalizate, cu afectiuni respiratorii preexistente, sau care se afla sub corticoterapie). Boala pulmonara poate sa apara sporadic (ca pneumonie comunitara, legionelele fiind responsabile de 3-8% din cazuri) sau in epidemii. Pneumonia apare mai frecvent la persoanele imunodeprimate si se caracterizeaza printr-o evolutie progresiva care in absenta tratamentului se poate extinde la mai muti lobi pulmonari. Boala debuteaza dupa o perioada de incubatie de de 2-10 zile cu febra, frisoane, tulburari respiratorii, tuse, confuzie. Histologic, este prezent un infiltrat alveolar cu neutrofile si macrofage, insotit de fibrina si extravazare de hematii. O forma mai usoara de manifestare a infectiei este febra Pontiac (denumita dupa locul primei epidemii care a avut loc la Pontiac-Michigan) care este intalnita in special la persoanele imunocompetente. Aceasta evolueaza ca o infectie respiratorie asemanatoare gripei, dupa o incubatie de 6-12 ore: febra, frisoane, mialgii, stare de curbatura, cefalee, tuse usoara. Manifestarile extrapulmonare ale infectiei cu Legionella pneumophila sunt rare, fiind reprezentate in special de endocardite, encefalite sau infectii ale plagilor^1;3;4;5. Pneumonia, febra Pontiac si infectiile extrapulmonare constituie cele 3 manifestari clinice primare ale legionelozei.

Aproximativ 85% din cazurile documentate de legioneloza sunt produse de Legionella pneumophila. Desi sunt cunoscute 15 serogrupuri de L. pneumophila, serogrupurile 1 si 6 sunt raspunzatoare de pana la 75% din cazurile de legioneloza⁵.

Mecanismele exacte prin care Legionella pneumophila cauzeaza boala nu sunt complet elucidate, totusi este cunoscut faptul ca abilitatea acesteia de a se sustrage fagocitozei detine un rol semnificativ in aparitia bolii.  De asemenea, existenta unui sistem imun celular competent este important in eliminarea infectei. Limfocitele T activate produc limfokine care stimuleaza activitatea antimicrobiana a macrofagelor, impiedicand astfel replicarea intracelulara a bacteriei¹. 

Diagnosticul de certitutine a al infectiei este stabilit prin izolarea patogenului pe un mediu de cultura special: agar tamponat cu carbune si extract de drojdie (BCYE) la pH 6.9.  De asemenea, prelevatele respiratorii pot fi examinate microscopic printr-o tehnica de imunofluorescenta directa cu anticorpi specifici, dar sensibilitatea metodei este redusa (25-70%). Datorita caracterului interstitial al pneumoniei este adesea dificil sa se recolteze sputa de la pacient. In absenta procedurilor invazive (ex. lavaj bronhoalveolar) pot fi utile detectia antigenului Legionella in urina sau testele serologice cu determinarea in dinamica a titrurilor de anticorpi.

In 1979 s-a constat ca in urina pacientilor cu boala legionarilor este prezent un antigen solubil specific. Acest antigen este detectabil la 3 zile dupa debutul simptomelor, fiind astfel un marker precoce de diagnostic, cu o sensibilitate de 70-80% si o specificitate de 97-100%⁵.

Diagnosticul serologic este cel mai adesea retrospectiv deoarece seroconversia se produce in cateva saptamani; confirmarea bolii se realizeaza prin cresterea de patru ori a titrului anticorpilor (> 1/128) in doua probe perechi: prima recoltata in faza acuta a bolii, cealalta la un interval de 2-3 saptamani^2;3. Sunt disponibile si teste imunoenzimatice care detecteaza separat anticorpii de tip IgG si IgM².

Pregatire pacient – testul nu necesita o pregatire prealabila².

Specimen recoltat

Antigen Legionella – o proba de urina spontana.

Serologie Legionella – sange venos².

Recipient de recoltare

Antigen Legionella – eprubeta pentru urina.

Serologie Legionella – vacutainer fara anticoagulant cu/fara gel separator².

Prelucrare necesara dupa recoltare

Antigen Legionella – nu este necesara.

Serologie Legionella – se separa serul prin centrifugare².

Volum proba

Antigen Legionella – 10 mL.

Serologie Legionella – minim 2 mL ser².

Cauze de respingere a probei

Antigen Legionella – specimen care nu a fost pastrat la 2-8°C, specimen contaminat cu materii fecale.

Serologie Legionella – specimen hemolizat, lipemic sau contaminat bacterian². 

Stabilitate proba

Antigen Legionella  – urina este stabila 14 zile la 2-8ºC. 

 Serologie Legionella – serul separat este stabil cateva ore la temperatura camerei; cateva zile la 2-8ºC; o perioada   mai indelungata la –20ºC².

Metoda

Antigen Legionella  – metoda imunoenzimatica (EIA). Este detectat antigenul Legionella pneumophila serogrup 1.

Serologie Legionella – Pot fi folosite 2 metode:

2. a)imunofluorescenta indirecta².Reactivul de baza contine 3 amestecuri antigenice provenite de la: Legionella pneumophila serogrupuri 1-6, Legionella pneumophila serogrupuri 7-14, alte tipuri de Legionella: L. bozmanii, L. dumofii, L. gormanii, L. longbeachae, L. micdadei, L. jordanis. Aceasta constelatie antigenica faciliteaza diagnosticul serologic a peste  99% din cazurile de legioneloza².
3. b) imunoenzimatica (EIA). Reactivul contine un amestec antigenic provenit de la Legionella pneumophila serogrupuri 1-7. Sunt detectati cantitativ anticorpii de tip IgG si IgM cu o sensibilitate si o specificitate de 94.3% si respectiv 82.5%.

Valori de referinta 

Antigen Legionella  – Negativ.

Serologie Legionella

a)< 1/128: Negativ;

1. b) Legionella IgG: <50 U/mL;

Legionella IgM: 120 U/mL².

Interpretarea rezultatelor

Antigen Legionella 

Prezenta antigenului in urina confirma infectia recenta sau in antecedente cu Legionella pneumophila serogrup 1.

Serologie Legionella

1. a) Este sumarizata in tabelul de mai jos:

Titru	Tip rezultat	Interpretare
< 1/128	Negativ	Nu au fost detectati anticorpi specifici.
1/128 – 1/256	Echivoc	A fost detectat un titru foarte scazut de anticorpi specifici : – titru restant post-infectie; – infectie in stadiu precoce. Se recomanda retestarea peste 2-3 saptamani.
> 1/256	Pozitiv	Probabilitate de infectie recenta. Se recomanda retestarea peste 2-3 saptamani.

2. b) O seroconversie IgG/IgM negativ → pozitiv sau obtinerea unor titruri inalte IgG/IgM in seruri-perechi este sugestiva pentru legioneloza².

Limite si interferente

Antigen Legionella 

Un rezultat negativ nu infirma o infectie cu Legionella. Acesta se poate datora urmatoarelor cauze:

-existenta unui foarte scazut de antigen in proba sub limita de detectie a metodei;

-infectia este determinata de alte serogrupuri de L. pneumophila sau de alte tipuri de Legionella;

-interferenta determinata de tratamentul diuretic;

-excretie antigenica mult diminuata la unii pacienti la care s-a initiat tratamentul antibiotic specific.

Excretia urinara a antigenului prezinta variatii individuale; la unele persoane poate persista pana la un an dupa infectia acuta, astfel ca in aceste cazuri un rezultat pozitiv indica o infectie in antecedente. De aceea, orice rezultat trebuie interpretat an contextul clinic al pacientului^4;5.

Serologie Legionella

Un rezultat negativ nu infirma o infectie cu Legionella deoarece uneori este nevoie de o perioada de 4-6 saptamani pentru a se obtine titruri detectabile ale anticorpilor. In unele cazuri nivelurile anticorpilor pot sa devina nedetectabile in decurs de o luna, sau tratamentul antibiotic precoce poate suprima raspunsul umoral. Mai mult, unele persoane nu dezvolta anticorpi peste limita de detectie a metodei.

Un singur rezultat pozitiv indica doar expunerea imunologica fara a preciza momentul contractarii infectiei. Desi titrurile >1/ 512 sunt sugestive pentru o legioneloza acuta este nevoie de testarea in dinamica. Acelasi lucru este valabil si in cazul detectiei anticorpilor prin metoda imunoenzimatica².

Bibliografie

1. Betty A.Forbes, Daniel F.Sahm, Alice S.Weissfeld. Legionella. In Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology. Mosby, USA, 11 ed. 2002; 37: 424-429.
2. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.
3. Olga-Mihaela Dorobat.Genul Legionella. In Bacteriologie Medicala. Universitatea “Titu Maiorescu”, Romania ed. 2006.
4. Richard A. McPetersen, Matthew R. Pincus Medical Bacteriology.. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods- Sauders Elsevier 21-Ed 2007- pg 1039, 1040.
5. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: Legionella pneumophila, Antibody, Serum. Legionella Antigen, Urine. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.