Laborator Synevo
Informatii generale
Termenul de rezistenta la proteina C activata descrie incapacitatea proteinei C activate (APC) de a anticoagula plasma, iar aceasta conditie este asociata cu o predispozitie crescuta pentru tromboze venoase.
Mecanismul rezistentei la proteina C activata a devenit mai bine cunoscut o data cu identificarea in 1994 a mutatiei punctiforme G1691A de la nivelul genei care codifica factorul V al coagularii. Ca urmare a acestei mutatii este generat un factor V anormal (factorul V Leiden), caracterizat prin inlocuirea argininei din pozitia 506 cu glutamina si modificarea consecutiva a situsului de legare a APC. Ulterior a fost identificat si un alt defect cauzat de mutatia G1691A si anume incapacitatea factorului V Leiden de a actiona ca un cofactor in procesul de degradare a FVIII activat de catre APC.
APC inactiveaza FVa prin clivarea a 3 legaturi de la nivelul lantului greu (amino-terminal): Arg506, Arg306, Arg679. Clivarea de la nivelul Arg506 este necesara pentru expunerea eficienta a celorlalte 2 situsuri de clivare, iar absenta sa determina rezistenta la APC.
Factorul V Leiden reprezinta principala cauza de APCR, fiind prezent la aproximativ 90% dintre pacienti. In absenta factorului V Leiden, APCR constituie un factor de risc independent pentru tromboza venoasa, riscul corelandu-se direct proportional cu gradul rezistentei. Printre conditiile asociate cu APCR in absenta factorului V Leiden se numara: nivelul crescut de FVIII, sarcina, administrarea de contraceptive orale, terapia hormonala de substitutie, prezenta anticoagulantului lupic.
APCR in absenta factorului V Leiden este mult mai frecventa la femei decat la barbati ceea ce indica o predispozitie mai mare pentru tromboze post-operatorii la persoanele de sex feminin. Pe de alta parte, cea mai mica incidenta a APCR este intalnita la indivizii cu grupa sangvina O, deoarece acestia prezinta un nivel relativ mai scazut de FVIII.
Factorul V Cambridge, o conditie rara generata de o mutatie care determina inlocuirea argininei din pozitia 306 cu treonina, este de asemenea asociat cu APCR. Pana in prezent nu a fost identificata nici o mutatie la nivelul celui de-al treilea situs de clivare al FVa (Arg679)1.
Recomandari pentru determinarea APCR – test screening pentru factorul V Leiden si alte cauze de APCR3.
Pregatire pacient – se va evita recoltarea probei de pe catetere heparinizate2.
Specimen recoltat – sange venos2.
Recipient de recolta – vacutainer cu citrat Na 0.105 M (1/9), capac bleu/verde2.
Cantitate recoltata – cat permite vacuumul2.
Cauze de respingere a probei – proba in cantitate inadecvata (sub nivelul indicat pe vacutainer); specimen hemolizat; prezenta de coaguli in proba2.
Prelucrare necesara dupa recoltare – centrifugare 15 min. la 2500 g pentru obtinerea plasmei(plasma trebuie sa fie foarte saraca in trombocite, T <10000/μL – dubla centrifugare), urmata imediat de separarea plasmei si congelarea acesteia; probele recoltate in afara laboratorului vor fi transportate in recipientul destinat probelor congelate1.
Stabilitate proba – plasma separata este stabila 1 luna la -20°C1.
Metoda – test de coagulare care actioneaza specific la nivelul complexului protrombinazei, prin utilizarea unui activator de protrombina dependent de FVa izolat dintr-un venin de sarpe; sunt eliminate astfel posibilele interferente exercitate de catre factorii situati in amonte in cascada coagularii precum si dependenta fata de ionii de calciu; intr-o prima etapa, plasma diluata a pacientului va fi incubata la 37°C cu un activator de factor V provenit din veninul de Daboia russeli, care converteste FV in FVa; coagularea va fi initiata in absenta calciului prin adaugarea unui activator de protrombina dependent de FVa izolat din veninul de Notechis scutatus; se efectueaza doua teste de coagulare cu si fara adaugarea de APC, dupa care se calculeaza raportul dintre cei doi timpi; adaugarea APC va alungi semnificativ timpul de coagulare la persoanele cu genotip salbatic, in timp ce pacientii cu factor V Leiden prezinta rezistenta la APC, astfel ca timpul lor de coagulare nu va fi influentat semnificativ de adaugarea acestui reactiv; reactivii contin un inhibitor de heparina ceea ce permite efectuarea testului la pacienti aflati sub heparinoterapie, avand concentratii ale heparinei ≤2UI/mL2.
Valori de referinta – ≥2.5 (raport)2.
Limite si interferente
Obtinerea unui rezultat pozitiv necesita efectuarea testului genetic care depisteaza mutatia factorului V Leiden si stabileste statusul homozigot/heterozigot.
In unele cazuri (la valori de granita ale raportului) testul poate esua in distingerea indivizilor heterozigoti pentru factorul V Leiden fata de normali.
Testul nu detecteaza rezistenta la proteina C activata de cauza dobandita.
Deficitul de fibrinogen, protrombina, FVIII, FX, ATIII, proteina C, proteina S (pana la 100%), cat si excesul de fibrinogen, factor VIII, sau ATIII (de pana la 5 ori normalul) nu influenteaza semnificativ valoarea raportului si sensibilitatea testului2.
Prezenta anticoagulantului lupic nu exercita influenta asupra testului. In urma unor studii efectuate s-a constatat ca de asemenea sarcina, contraceptivele orale si anticoagulantele orale nu afecteaza performanta testului4.
Deficitul important de factor V in plasma (<50%) poate conduce la timpi de coagulare alungiti si astfel se poate pierde performanta discriminatorie. Prezenta aprotininei (care inhiba APC utilizata in test) sau a protaminei in plasma pacientului poate conduce la scaderea timpilor de coagulare si de asemenea la afectarea capacitatii discriminatorii. Inhibitorii directi ai trombinei (hirudin, argatroban) influenteaza timpii de coagulare si valoarea raportului. Din aceste motive, trebuie intrerupt tratamentul cu aprotinina, protamina sau inhibitori de trombina cu cel putin 24 ore inaintea recoltarii2.
Bibliografie
- Ian Jennings, Peter Cooper. Screening for Thrombophilia: A Laboratory Perspective. In British Journal of Biomedical Science, 2003.
- Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog
- Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Activated Protein C Resistance www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.
- Reta Schöni, Peter Quehenberger, Jogin R Wu, Marianne Wilmer. Clinical evaluation of a new functional test for detection of activated protein C resistance (Pefakit® APC-R Factor V Leiden) at two centers in Europe and the USA. In Thrombosis Research 2007; 119(1): 17-26.