Electroforeza hemoglobinei

Informatii generale

Hemoglobina reprezinta elementul esential pentru principala functie fiziologica a eritrocitului: functia respiratorie. Hemoglobina este o cromoproteina porfirinica care contine fier, in structura sa intrand o parte proteica – globina – si o parte prostetica – hemul. Globina difera ca structura de la o hemoglobina la alta, ea imprimand specificitate diverselor hemoglobine cunoscute.

In cursul dezvoltarii organismului de la embrion la adult se succeda mai multe tipuri de Hb; hemoglobinele embrionare Gower 1, Gower 2 si Portland sunt inlocuite incepand cu cea de-a 3-a luna de gestatie de catre Hb fetala (HbF), care reprezinta 70-80% din totalul Hb la nou-nascut, dupa care sinteza sa scade rapid, ajungand la sfarsitul primului an de viata la valori sub 2% din totalul Hb. Hb A si Hb A₂sunt caracteristice perioadei adulte de dezvoltare; sinteza lor incepe inca  din perioada fetala, iar dupa nastere ele inlocuiesc rapid Hb F. La adultul normal, Hb A reprezinta 97-98%, HbA₂ 2-3%, iar HbF sub 1%¹.

Lanturile polipeptidice α, β, γ si δ ale globinei alcatuiesc hemoglobinele fiziologice (fiecare molecula de hemoglobina contine doua perechi de lanturi polipeptidice), lantul α fiind comun celor trei hemoglobine:

HbA = α2 β2               

HbA2 = α2 δ2

HbF = α2 γ2.

Ca si in cazul celorlalte proteine structura spatiala a hemoglobinei precum si alte proprietati moleculare depind de tipul si secventa de aminoacizi care intra in alcatuirea hemoglobinei. Substitutia unor aminoacizi din lanturile polipeptidice ca urmare a mutatiilor genetice genereaza variante anormale de hemoglobina ce prezinta o incarcare electrica diferita si in consecinta mobilitati electroforetice diferite. Pe de alta parte, scaderea ratei de sinteza a unui tip de lant al globinei da nastere la anomalii cantitative denumite sindroame talasemice.

Metodele electroforetice sunt utilizate de rutina in screening-ul anomaliior hemoglobinei. Dintre acestea cea mai cunoscuta este electroforeza Hb in mediu alcalin (pH 8.2-8.6) folosind ca suport de migrare gelul de agaroza. La pH alcalin hemoglobina prezinta o sarcina electrica negativa si va migra catre anod. Prin aceasta metoda pot fi separate si identificate hemoglobinele fiziologice HbA, HBA2, HbF si migreaza de asemenea o serie de variante de hemoglobina, cum ar fi HbS, HbD, HbG, Hb Lepore, HbC, HbO-Arab, care genereaza majoritatea hemoglobinopatiilor cunoscute.

La rularea fiecarui set de probe este folosit un control ce contine hemoglobinele A, F, S si C. Deoarece este utilizata o coloratie pentru proteine si nu una pentru hem, anhidraza carbonica (enzima cu un continut crescut in eritrocite) va fi vizualizata suplimentar in spatele benzii A2. Pentru identificarea fractiunilor Hb pozitia benzilor obtinute este comparata cu cea a benzilor standard furnizate de materialul de control pozitia benzilor obtinute fiind comparata cu cea a benzilor standard furnizate de materialul de control (vezi fig.1). Cuantificarea relativa a benzilor obtinute se face prin scanarea densitometrica a gelului electroforetic^1;3.

  ––– 

Fig. 1 Migrarea fractiunilor Hb la electroforeza in gel de agaroza la pH alcalin

Cu toate acestea electroforeza hemoglobinei in gel de agaroza la pH alcalin prezinta limitari importante:

-variatii mari in cuantificarea HbA2, ceea ce afecteaza identificarea corecta a beta-talasemiilor;

– imposibilitatea separarii HbS de HbD si a HbC de HbE si HbA2 (vezi fig.1).

Din aceste motive in laboratorul nostru se utilizeaza in prezent electroforeza capilara pentru separarea fractiunilor Hb. Prin aceasta tehnica, complet automatizata, moleculele incarcate electric sunt separate pe baza mobilitatii electroforetice proprii intr-o solutie tampon alcalina. Separarea se produce de asemenea si in functie de pH-ul solutiei electrolitice si de fluxul electroosmotic.

Sistemul electroforetic este alcatuit din tuburi capilare de silica (SiO2) cu d<100 μ care functioneaza in paralel ceea ce permite 7 analize simultane pentru cuantificarea unei fractiuni de Hb. Proba diluata cu solutia hemolizanta este injectata la capatul anodic al capilarului; se aplica apoi un voltaj inalt pentru separarea fractiunilor Hb care vor fi apoi detectate la 415 nm de catre detectorul de absorbanta plasat la capatul catodic al capilarului. Astfel, fractiunile Hb sunt detectate direct si specific la lungimea de unda caracteristica Hb. In final, pe ecranul analizorului vor fi afisate pozitiile potentiale ale fractiunilor Hb obtinute (identificate in zonele denumite Z1 →Z15) precum si cuantificarea acestora. Prin utilizarea unui tampon cu pH alcalin fractiunile Hb normale sau anormale vor fi detectate in urmatoarea ordine de la catod la anod (Z1 →Z15): δA’2 (varianta de HbA2), C, A2/O-Arab, E, S, D, G-Philadelphia, F, A, Hope, Bart, J, N-Baltimore si H.

Electroforegramele rezultate vor fi inspectate vizual pentru a stabili daca s-a obtinut un profil normal sau modificat (vezi fig.2,3).

–––-

Fig. 2  Electroforegrama Hb cu aspect normal (adult)

 –––

Fig. 3  Electroforegrama Hb cu aspect normal (copil de 3 saptamani)

  

Avantajele utilizarii electroforezei capilare sunt urmatoarele:

-cuantificare mai buna a HbA2 pentru identificarea beta-talasemiilor minore (datorita mai multor analize simultane);

-diferentierea HbS de HbD precum si a HbC de HbE si HbA2 (aceste fractiuni co-migreaza la electroforeza Hb in gel de agaroza in mediu alcalin);

-deoarece nu este vizualizata anhidraza carbonica pe eletroforegrama este posibila identificarea variantelor de HbA2 in zona Z1 (detectarea unei variante de HbA2 este importanta pentru diagnosticul corect al beta-talasemiilor minore deoarece se insumeaza la HbA2 normala)².

Recomandari pentru efectuarea electroforezei de hemoglobina – diagnosticul hemoglobinopatiilor si sindroamelor talasemice a caror suspiciune este indicata de:

• anemie hemolitica cronica;
• criza ocluziva vasculara de cauza necunoscuta la un pacient provenit din zone cu niveluri crescute ale Hb S si/sau Hb C;
• sindrom de hidrops fetal de cauza necunoscuta³;
• aspect sugestiv al hemogramei, cu microcitoza si hipocromie mai severe decat ar fi de asteptat pentru gradul anemiei si numar de eritrocite la limita superioara a normalului sau chiar crescut, asociate cu un numar mare de hematii „in tinta” si punctatii bazofile pe frotiul de sange. In aceasta situatie, pentru diferentierea de deficitul de fier, sunt utile indicele Mentzer si indicele RDW:

Indicele Mentzer = VEM/nr. de eritrocite (x10⁶)

                        >14       sugestiv pentru deficit de fier;

                        12-14    echivoc

                        <12       sugestiv pentru tara talasemica.

Indicele RDW = Indicele Mentzer x RDW (largirea distributiei eritrocitare).

                          < 220:    sugestiv pentru talasemie;

                          ≥ 220:    sugestiv pentru anemia feripriva⁴.

Pregatire pacient – à jeun (pe nemancate) sau postprandial (dupa mese)².

Specimen recoltat – sange venos².

Cauze de respingerea probei – specimen coagulat sau care a depasit perioada de stabilitate².

Recipient de recoltare – vacutainer cu K3 EDTA².

Cantitate recoltata – cat permite vacuumul².

Stabilitate proba – sangele integral este stabil 7 zile la 2-8°C; in nici un caz vacutainerul cu sange recoltat pe K3 EDTA nu se introduce in congelator!!! (se produce hemoliza)².

Metoda – electroforeza capilara; la fiecare rulare a probelor se utilizeaza un control HbA2 normal².

Valori de referinta

Pentru cele 3 fractiuni fiziologice se inregistreaza variatii in functie de varsta²:

  

Varsta	HbA	HbA2	HbF
<2 luni	17.7-54	≤1.3	46-81
2-3 luni	37.1-70.6	0.4-1.9	29-61
3-4 luni	41-84	1-3	15-56
4-5 luni	68.2-88.6	2-2.8	9.4-29
5-6 luni	74.9-95.6	2.1-3.1	2.3-3.2
6-9 luni	83.5-95.8	1.9-3.5	2.3-1.3
9-13 luni	91.7-96.7	2-3.3	1.3-5
≥13 luni	96.7-97.8	2.2-3.2	≤0.5

 

Interpretarea rezultatelor

• in β-talasemia minima si minoravalorile  Hb A₂ sunt crescute (3.2%- 7%), iar Hb F este usor crescuta (0.5-6%) in peste 50% din cazuri, restul fiind reprezentat de Hb A (vezi fig.4);

––––

Fig. 4  Electroforegrama unui pacient cu beta-talasemie minor

 

• in β-talasemia intermedia, procentul de Hb A₂ este variabil, iar Hb F = 20-80%;
• in β-talasemia majora, valorile de  Hb F sunt foarte crescute, situate obisnuit intre 20-90% din totalul Hb, restul fiind format de  Hb A (valori foarte scazute) si HbA₂ (valori normale sau crescute); se caracterizeaza clinic prin tabloul clasic al anemiei Cooley;
• in afara de tipurile amintite, mai exista forme de β- talasemie cu valori normale de Hb A₂si Hb F “silent thalassemia” cu indici eritrocitari normali si “almost silent thalassemia” cu indici eritrocitari modificati) care pot fi puse in evidenta prin tehnici de genetica moleculara^3;5;
• δβ-talasemia rezulta din deletia genelor δsi β cu mentinerea integritatii genelor γ, in timp ce in ^Aγδβ-talasemiase inregistreaza deletia genelor ^Aγ, δ si β cu mentinerea integritatii genei ^Gγ; heterozigotii prezinta un tablou hematologic similar β-talasemiei minore dar la electroforeza Hb, procentul de Hb A2 tinde sa fie redus la jumatate iar Hb F este persistent crescuta intr-o proportie de 5-20%; homozigotii prezinta un fenotip similar β-talasemiei intermedia iar electroforeza evidentiaza Hb F intr-un procent de aproape 100%; testarea genetica confirma diagnosticul³;
• Hb Leporeeste o hemoglobina anormala, in care lanturile α sunt normale, iar lanturile non-α au o structura asemanatoare lanturilor δ la capatul N-terminal si lanturilor β la capatul C-terminal. Sindromul Lepore, foarte asemanator clinic in forma sa heterozigota cu  β-talasemia minora, se caracterizeaza prin prezenta Hb Lepore intr-un procent de 5-10 %, cu o pozitie asemanatoare HbD la electroforeza capilara (in zona Z6); in forma homozigota, asemanatoare clinic cu anemia Cooley,  Hb Lepore reprezinta 10-20%, restul fiind format de HbF (Hb A si Hb A₂ lipsesc in totalitate)^1;2;
• persistenta ereditara de Hb Feste o entitate asimptomatica clinic si hematologic, caracterizata prin valori crescute de Hb F, la heterozigoti Hb F = 15-30%, iar la homozigoti se poate ajunge pana la 100% Hb F, in afara oricarui semn de boala⁵;
• in forma heterozigota desiclemie (“sickle cell trait”), electroforeza capilara evidentiaza o Hb anormala in Z5, Hb S, in proportie de 25-45%, Hb A₂fiind in cantitate normala, iar restul fiind reprezentat de Hb A (vezi fig.5); cei mai multi pacienti cu tara de siclemie sunt asimptomatici, cu un frotiu de sange normal sau usor modificat (microcitoza sau hematii “in tinta”); coexistenta tarei Hb S cu anumite tipuri de talasemii sau alte hemoglobinopatii modifica tabloul clinic si hematologic precum si electroforeza Hb^2;3;

––––-

Fig. 5 Eletroforegrama unui pacient cu forma heterozigota de siclemie

 

• in forma homozigota de siclemie (“sickle cell anemia”), electroforeza Hb indica prezenta Hb S in proportie de 90-95%, restul fiind reprezentat de Hb A2 si Hb F; tabloul hematologic este normal la nastere si incepe sa se modifice dupa varsta de 6 luni, pe masura ce Hb F este inlocuita de Hb S³;
• in hemoglobinopatia C, la electroforeza Hb in gel de agaroza in mediu alcalin, HbC se izoleaza  ca o fractie anormala, cu migrare foarte lenta, pe linia Hb A₂, in aceeasi pozitie  cu Hb E si Hb O_Arabia, intr-un procent de 38-44%laheterozigoti; pentru diferentierea Hb C de Hb E si Hb O_Arabia este necesara efectuarea electroforezei la un pH acid (6-6.2); la electroforeza capilara HbC este identificata separat in Z2 (vezi fig.6)^1;2; prezenta tarei Hb C nu prezinta semnificatie clinica insa este importanta in consilierea genetica a cuplurilor; homozigotii pentru Hb C (boala hemoglobinei C) prezinta urmatoarele caracteristici: anemie usoara/medie cu microcitoza marcata, numeroase hematii “in tinta” pe frotiul de sange periferic, iar la electroforeza hemoglobinei se izoleaza Hb C in proportie de 95%, restul fiind reprezentat de Hb A2 si Hb F³;

–––––

 Fig. 6 Electroforegrama unui pacient cu forma heterozigotade hemoglobinopatie C

 

• in α- talasemia minora nu exista modificari procentuale ale Hb A, Hb A₂ si Hb F, iar electroforeza de Hb apare normala la subiectul adult heterozigot, insa dublu heterozigotii realizeaza “boala Hb H”, cu aspect clinic de talasemie intermedia; la electroforeza Hb in gel de agaroza la pH alcalin se poate evidentia  o fractiune anormala cu migrare rapida (cea mai apropiata de anod) in timp ce la electroforeza capilara se detecteaza o fractiune anormala in pozitia Z15 (vezi fig.7) corespunzatoare Hb H (5-30%). Pe frotiul de sange colorat supravital pot fi observate incluziile HbH  (precipitatele de lanturi β), intr-un procent ridicat de eritrocite (35-90%) cu aspect caracteristic de „minge de golf”^1;2. Genetica moleculara asigura insa diagnosticul de certitudine al tuturor formelor de α- talasemie³.

––––

Fig. 7 Electroforegrama unui pacient cu “boala Hb H”

 

Limite si interferente

 Transfuziile de sange pot dilua o eventuala hemoglobina anormala, pentru o perioada de 3-4 luni, interferand cu rezultatele electroforezei⁵.

Hiposideremia poate determina obtinerea de valori fals scazute pentru Hb A2; daca exista o neconcordanta intre rezultatul obtinut pentru HbA2 si suspiciunea clinica de betatalasemie minor, pacientul va fi tratat cu fier, pana la normalizarea sideremiei, apoi se va repeta electroforeza de hemoglobina³.

• Interferente analitice

In probele de sange  care au depasit perioada de stabilitate se produce o degradare progresiva a fractiunilor Hb ceea ce poate afecta profilul electroforetic².

Bibliografie

1. Predescu C. Sindroamele talasemice. In Tratat de Medicina Interna, Hematologie, partea I (Coordonator Dan Colita). Ed. Med. Buc., 1997; 779-802.

2. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2013. Ref Type: Catalog.
3. Bain B, J. Haemoglobinopathy Diagnosis. Blackwell Science, 2001, 20-25.
4. Glader B. Anemia: General Considerations. In Wintrobe`s Clinical Hematology. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 11th edition, 2004, 962.

5. Thomas L. Hemoglopinopathies. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1 ed., 1998; 489-493.