Citochimie PAS

Laborator Synevo

 

Citochimia se bazeaza pe studiul microscopic al componentilor chimici celulari: nucleoproteine, proteine, hidrati de carbon, lipide si enzime.

Coloratiile citochimice ofera informatii in legatura cu linia celulara si diferentierea celulelor hematopoietice si joaca un rol important in evaluarea anomaliilor hematologice, in special in diagnosticul diferential si clasificarea bolilor maligne ale sangelui.

Un principiu de care trebuie tinut seama este faptul ca, o reactie pozitiva este intotdeauna valoroasa, in timp ce reactia negativa este neconcludenta. Pentru certitudine, in majoritate cazurilor reactiile citochimice se practica cu un martor pozitiv al reactiei^1;2.

Reactii citochimice	LAM – M1,M2	LAM – M3	LAM – M4	LAM – M5	LAM –M6	LAM – M7	LAL
MPO	+	++	+	– , +/-	–	–	–
PAS	– , +/-	– , +	– , +/-	– , +	+	+	– , + , ++
ANAE	–	– , +	+	++	+	+	– , +/-

– negativ ; +/- slab pozitiv ; + pozitiv ;+ + intens pozitiv.

Un diagnostic corect de laborator al LAM, cu subtipurile FAB si LAL necesita coroborarea datelor de microscopie optica – morfologie si coloratii citochimice – cu imunofenotiparea, eventual datele de microscopie electronica.

Informatii generale

In celulele sangvine reactia pozitiva este datorata in primul rand prezentei de glicogen citoplasmatic. Acumularea de glicogen se considera a fi un indicator al dereglarii metabolismului acestuia.

Multe din celulele sangvine prezinta o reactie PAS pozitiva in citoplasma. Intensitatea acestei reactii si tipul de colorare variaza cu tipul celular¹.

Principiul reactiei

Reactivul Schiff este o solutie incolora obtinuta prin reducerea fucsinei bazice. Acidul periodic oxideaza grupul glicol sau derivatii sai. Rezultatul este producerea de aldehide care reactioneaza cu reactivul Schiff pentru a produce o culoare purpurie^1;3.

Recomandari pentru determinarea PAS

– diagnosticul leucemiei acute limfoblastice (LAL) subtipurile L1 si L2;

– diagnosticul de sindrom mielodisplazic ori LAM-M6 prin evidentierea eritroblastilor PAS-pozitivi;

– diferentierea celulelor Gaucher si a histiocitelor cu granule „albastre ca marea” de alte tipuri de macrofage¹. 

Pregatire pacient – à jeun (pe nemancate) sau postprandial (dupa mese)³.

Specimen recoltat

1. a) sange capilar si/sau aspirat medular – frotiuri
2. b) se recomanda recoltarea simultana de sange venos pentru hemograma³.

Cauze de respingerea probei 

-frotiuri nefixate in maxim 8 ore de la recoltare;

-frotiuri executate din sange recoltat pe EDTA³.

Recipient de recoltare

1. a) se executa frotiuri de sange capilar direct pe lame de microscopie;
2. b) vacutainer cu EDTA K3 (capac mov), pentru hemograma³.

Cantitate recoltata 

1. a) 3-5 frotiuri;
2. b) 2 mL³.

Prelucrare necesara dupa recoltare 

Este preferabil ca fixarea frotiurilor sa se faca in primele 30 minute de la recoltare. Eventual, se poate face in primele 8 ore. Amestec fixator: alcool etilic 9 parti + formol 40% 1 parte. Fixarea se cronometreaza 30 secunde, dupa care frotiurile se spala cu jet de apa de robinet. Frotiurile fixate se pot colora imediat sau se pot pastra cateva zile la temperatura camerei, pana la colorare³.

Stabilitate proba

-frotiurile nefixate sunt stabile maxim 8 ore la 18-30ºC;

-frotiurile fixate sunt stabile 5 zile la temperatura camerei³.

Metoda – examinare microscopica³.

Interpretarea rezultatelor

Glicogenul apare colorat in rosu purpuriu, sub forma de granule sau difuz.

Martorul pozitiv al reactiei este reprezentat de granulocitul matur.

Granulocitele contin glicogen sub forma difuza incepand cu stadiul de promielocit unde apare roz si creste pe masura maturatiei. Bazofilele sunt moderat-intens PAS pozitive, frecvent prezentand gramezi amorfe in jurul nucleului. In leucemia acuta mieloblastica (LAM) pot exista mieloblasti  care prezinta granule rosii, mici sau medii. In faza blastica a leucemiei granulocitare cronice (LGC) blastii sunt frecvent PAS pozitivi, similar limfoblastilor din leucemia acuta limfoblastica. Promielocitele  din leucemia acuta promielocitara (LAM-M3), in special forma hipergranulara,  sunt de obicei PAS pozitive.

In mod normal, un numar mic (mai putin de 15%) de limfocite mature  pot fi PAS pozitive cu urmatoarele aspecte :

             1+ rare granule rosii, mici sau medii;

             2+ numar moderat granule rosii, mici sau medii;

             3+ inele de granule rosii, grosolane sau gramezi  de material amorf de culoare rosie in citoplasma sau acoperind nucleul.

In leucemia limfatica cronica (LLC) netratata si faza leucemica a limfoamelor, numarul de celule limfoide pozitive este de obicei crescut in mod semnificativ, dar acest rezultat nu este concludent.

In leucemia acuta limfoblastica (LAL) un numar variabil de limfoblasti pot fi PAS pozitivi 1+,2+,3+. Aspectul PAS pozitiv 3+ prezinta specificitate inalta pentru limfoblastii leucemici. Limfoblastii sunt caracterizati printr-o mare variabilitate a activitatii glicogenice: sunt PAS pozitivi doar in ~ 50% din cazurile de LAL-L1 si L2, in timp ce in LAL-L3 sunt constant negativi.

Cresterea glicogenului in limfocitele patologice nu este specifica leucemiei, ci se datoreaza cresterii activitatii metabolice care are loc in cursul oricarui tip de proliferare limfoida¹.

Monocitele sunt negative sau slab pozitive(1+). Precursorii monocitelor in leucemia acuta monocitara (LAM-M5) sunt frecvent pozitivi si pot prezenta granule mari sau gramezi amorfe, similar limfoblastilor leucemici, dar de obicei limitate la citoplasma. In leucemia acuta mielomonocitara (LAM-M4) blastii, cand sunt PAS pozitivi, prezinta un aspect fin granular.

Precursorii eritroizi normali sunt PAS negativi. Proeritroblastii si eritroblastii bazofili din eritroleucemie (LAM-M6)  pot prezenta un aspect granular, cu granule grosolane dispuse in jurul nucleului. Un aspect difuz PAS pozitiv, poate fi prezent in eritroblastii maturi din LAM-M6 si sindromul mielodisplazic (SMD).

Megacarioblastii, megacariocitele si plachetele sunt PAS pozitive. Megacarioblastii din LAM-M7 prezinta un aspect difuz sau cu granule dispuse periferic^1;4;5.

Limite si interferente 

Reactia PAS are valoare mica in diferentierea LAL de alte tipuri de LA cu diagnostic dificil si incert, datorita heterogenitatii limfoblastilor¹.

Bibliografie

1. Dan Colita. Tratat de Medicina Interna-Hematologie, partea a II-a (sub redactia Radu Paun), ed 1999, 1014-1026.
2. Lothar Thomas. Hematology. In Clinical Laboratory Diagnostics, ed 1998, 520.
3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog;
4. Marsha C.Kinney, John N.Lukens. Classification and differentiation of the acute leukemias. In Wintrobe’s Clinical Hematology, Philadelphia ed. 1999, 2211-2220.
5. Shafer J, Canadian Society of Laboratory Technologist Congress, Winnipeg, Manitoba, June 16 to 20, 1996, Workshop Manual, p 167-176.
6. Sherrie L. Perkins. Cytochemical Stains. In Wintrobe’s Clinical Hematology, Philadelphia ed. 1999, 26-27.