Citochimie peroxidaze

Laborator Synevo

 

Citochimia se bazeaza pe studiul microscopic al componentilor chimici celulari: nucleoproteine, proteine, hidrati de carbon, lipide si enzime.

Coloratiile citochimice ofera informatii in legatura cu linia celulara si diferentierea celulelor hematopoietice si joaca un rol important in evaluarea anomaliilor hematologice, in special in diagnosticul diferential si clasificarea bolilor maligne ale sangelui.

Un principiu de care trebuie tinut seama este faptul ca, o reactie pozitiva este intotdeauna valoroasa, in timp ce reactia negativa este neconcludenta. Pentru certitudine, in majoritate cazurilor reactiile citochimice se practica cu un martor pozitiv al reactiei^1;2.

Reactii citochimice	LAM – M1,M2	LAM – M3	LAM – M4	LAM – M5	LAM –M6	LAM – M7	LAL
MPO	+	++	+	– , +/-	–	–	–
PAS	– , +/-	– , +	– , +/-	– , +	+	+	– , + , ++
ANAE	–	– , +	+	++	+	+	– , +/-

 – negativ ; +/- slab pozitiv ; + pozitiv ;+ + intens pozitiv.

Un diagnostic corect de laborator al LAM, cu subtipurile FAB si LAL necesita coroborarea datelor de microscopie optica – morfologie si coloratii citochimice – cu imunofenotiparea, eventual datele de microscopie electronica.

Informatii generale

Reactia MPO este coloratia citochimica de electie pentru recunoasterea celulelor granulocitare, prezenta sa reprezentand singurul marker fara echivoc al diferentierii mieloide. Mieloperoxidaza este o enzima localizata in granulatiile azurofile ale celulelor seriilor granulocitare si monocitare si in granulatiile specifice ale eozinofilelor⁴. 

Principiul reactiei  

Peroxidazele celulare descompun apa oxigenata  si elibereaza oxigenul, care oxideaza benzidina si genereaza un compus brun-auriu insolubil si stabil, localizat in citoplasma celulelor peroxidazo-pozitive^1;3.

Recomandari pentru determinarea activitatii peroxidazei

–  diferentierea leucemiei acute mieloblastice (LAM) de cea limfoblastica (LAL);

–  demonstrarea corpilor Auer;

– detectarea scaderii activitatii, la subiectii cu deficit de MPO congenitala sau dobandita (in mielodisplazii)¹.

Pregatire pacient – à jeun (pe nemancate) sau postprandial (dupa mese)³.

Specimen recoltat

1. a) sange capilar si/sau aspirat medular – frotiuri
2. b) se recomanda recoltarea simultana de sange venos pentru hemograma³.

Cauze de respingerea probei 

-frotiuri nefixate in maxim 8 ore de la recoltare;

-frotiuri executate din sange recoltat pe EDTA³.

Recipient de recoltare

1. a) se executa frotiuri de sange capilar direct pe lame de microscopie;
2. b) vacutainer cu EDTA K3 (capac mov), pentru hemograma³.

Cantitate recoltata 

1. a) 3-5 frotiuri;
2. b) 2 mL³.

Prelucrare necesara dupa recoltare 

Este preferabil ca fixarea frotiurilor sa se faca in primele 30 minute de la recoltare. Eventual, se poate face in primele 8 ore. Amestec fixator: alcool etilic 9 parti + formol 40% 1 parte. Fixarea se cronometreaza 30 secunde, dupa care frotiurile se spala cu jet de apa de robinet. Frotiurile fixate se pot colora imediat sau se pot pastra cateva zile la temperatura camerei, pana la colorare³.

Stabilitate proba

-frotiurile nefixate sunt stabile maxim 8 ore la 18-30ºC;

-frotiurile fixate sunt stabile 5 zile la temperatura camerei³.

Metoda – examinare microscopica³.

Interpretarea rezultatelor

Granulele de culoare galben-bruna indica prezenta activitatii peroxidazelor celulare.

Reactia este intensa  in celulele seriei granulocitare. Martorul pozitiv al reactiei este reprezentat de granulocitul matur – granule mari in citoplasma si peste nucleu. Este discutabil daca mieloblastul normal este peroxidazo-pozitiv in microscopia optica. Reactia este pozitiva incepand de la stadiul de promielocit; sunt prezente o multitudine de granule galben-brune in citoplasma, care uneori mascheaza alte caracteristici citoplasmatice.

Pentru stabilirea diagnosticului de leucemie acuta mieloblastica (LAM) cel putin 3% din blasti trebuie sa fie peroxidazo-pozitivi. Mieloblastii prezinta de obicei granulele mari, localizate si mai reduse numeric decat promielocitele normale. Corpii Auer, rezultati din coalescenta anormala a granulatiilor azurofile, sunt intens peroxidazo-pozitivi.

Monocitele dau o reactie negativa sau slab pozitiva. Monoblastii din leucemia acuta monocitara (LAM-M5) sunt de obicei negativi, in timp ce monoblastii din leucemia acuta mielomonocitara (LAM-M4) pot fi slab pozitivi.

Limfocitele si eritrocitele nu au activitate MPO in nici un stadiu de maturare.

In concluzie, reactia pozitiva in blasti indica leucemie mieloblastica sau mielomonocitara^1;4;5.

Limite si interferente 

Obtinerea unei reactii pozitive in blasti are valoare diagnostica pentru leucemia acuta mieloblastica, in timp ce reactia negativa este neconcludenta. Rezultatul trebuie coroborat cu alte teste citochimice¹.

 Bibliografie

1. Dan Colita. Tratat de Medicina Interna-Hematologie, partea a II-a (sub redactia Radu Paun), ed 1999, 1014-1026.
2. Lothar Thomas. Hematology. In Clinical Laboratory Diagnostics, ed 1998, 520.
3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog;
4. Marsha C.Kinney, John N.Lukens. Classification and differentiation of the acute leukemias. In Wintrobe’s Clinical Hematology, Philadelphia ed. 1999, 2211-2220.
5. Shafer J, Canadian Society of Laboratory Technologist Congress, Winnipeg, Manitoba, June 16 to 20, 1996, Workshop Manual, p 167-176.
6. Sherrie L. Perkins. Cytochemical Stains. In Wintrobe’s Clinical Hematology, Philadelphia ed. 1999, 26-27.