Citochimie esteraze nespecifice

Laborator Synevo

 

Citochimia se bazeaza pe studiul microscopic al componentilor chimici celulari: nucleoproteine, proteine, hidrati de carbon, lipide si enzime.

Coloratiile citochimice ofera informatii in legatura cu linia celulara si diferentierea celulelor hematopoietice si joaca un rol important in evaluarea anomaliilor hematologice, in special in diagnosticul diferential si clasificarea bolilor maligne ale sangelui.

Un principiu de care trebuie tinut seama este faptul ca, o reactie pozitiva este intotdeauna valoroasa, in timp ce reactia negativa este neconcludenta. Pentru certitudine, in majoritate cazurilor reactiile citochimice se practica cu un martor pozitiv al reactiei^1;2.

Reactii citochimice	LAM – M1,M2	LAM – M3	LAM – M4	LAM – M5	LAM –M6	LAM – M7	LAL
MPO	+	++	+	– , +/-	–	–	–
PAS	– , +/-	– , +	– , +/-	– , +	+	+	– , + , ++
ANAE	–	– , +	+	++	+	+	– , +/-

-negativ ; +/- slab pozitiv ; + pozitiv ;+ + intens pozitiv.
Un diagnostic corect de laborator al LAM, cu subtipurile FAB si LAL necesita coroborarea datelor de microscopie optica – morfologie si coloratii citochimice – cu imunofenotiparea, eventual datele de microscopie electronica.

Informatii generale

Esterazele sunt enzime care hidrolizeaza esteri alfatici si aromatici si sunt utile pentru a distinge celulele seriei granulocitare de celulele seriei monocitare.

Naphthol AS-D cloracetat esteraza este prezenta in celulele liniei granulocitare si se gaseste in cantitate mica sau este absenta in monocite si precursorii monocitelor.

Esteraza nespecifica este, asa cum ii arata si numele, o enzima ubiquitara prezenta in mai multe tipuri de celule, printre care: monocite,celule T si megacariocite. Poate utiliza ca substraturi: alfa-naftil acetat, alfa-naftil butirat, naftol AS- D acetat⁴.

Principiul metodei

Ne vom referi la reactia alfa-naftil acetat esteraza (ANAE): alfa-naftil acetatul este hidrolizat de esteraze in alfa-naftol, care in prezenta unei sari de diazoniu formeaza un compus de culoare rosu-brun, insolubil in apa^1;3.

Recomandari pentru determinarea esterazelor nespecifice

– diagnosticul LA monocitare tipurile M4 si M5¹.

Pregatire pacient – à jeun (pe nemancate) sau postprandial (dupa mese)³.

Specimen recoltat

1. a) sange capilar si/sau aspirat medular – frotiuri
2. b) se recomanda recoltarea simultana de sange venos pentru hemograma³.

Cauze de respingerea probei

-frotiuri nefixate in maxim 8 ore de la recoltare;

-frotiuri executate din sange recoltat pe EDTA³.

Recipient de recoltare

1. a) se executa frotiuri de sange capilar direct pe lame de microscopie;
2. b) vacutainer cu EDTA K3 (capac mov), pentru hemograma³.

Cantitate recoltata

1. a) 3-5 frotiuri;
2. b) 2 mL³.

Prelucrare necesara dupa recoltare

Este preferabil ca fixarea frotiurilor sa se faca in primele 30 minute de la recoltare. Eventual, se poate face in primele 8 ore. Amestec fixator: alcool etilic 9 parti + formol 40% 1 parte. Fixarea se cronometreaza 30 secunde, dupa care frotiurile se spala cu jet de apa de robinet. Frotiurile fixate se pot colora imediat sau se pot pastra cateva zile la temperatura camerei, pana la colorare³.

Stabilitate proba

-frotiurile nefixate sunt stabile maxim 8 ore la 18-30ºC;

-frotiurile fixate sunt stabile 5 zile la temperatura camerei³.

Metoda – examinare microscopica³.

Interpretarea rezultatelor

In monocite, activitatea enzimatica a ANAE se evidentiaza prin aparitia unui compus rosu-brun, cu aspect difuz, moderat sau intens colorat (tip M –monocitar). In celulele T (inclusiv limfoblastii T) si megacarioblasti, aspectul este mai mult focal, in regiunea Golgi sau paranuclear. Aspectul colorarii este util, intr-o anumita masura, in diferentierea tipurilor de celule.

Etapa de inhibare cu NaF a fost adaugata pentru a face esteraza nespecifica „mai specifica”. Activitatea enzimei in celulele liniei monocitare este inhibata de NaF, in timp ce in restul celulelor activitatea persista.

Alfa-naftil acetat esteraza este obisnuit negativa in celulele de serie granulocitara. Celulele blastice din LAM-M0, M1 si M2 sunt de obicei negative. In LAM–M3 esteraza nespecifica este pozitiva in 20-30% din cazuri, fiind mai slaba ca intensitate decat in monocite; reactia este sensibila la inhibare cu NaF in aproximativ 1/3-1/2 din cazurile pozitive.

Celulele blastice monocitare din LAM-M4 au activitate ANAE intens pozitiva, difuza (tip M) in proportie de peste 20%, iar in cele din LAM-M5 in proportie de peste 80%, sensibila la NaF.

Megacarioblastii leucemici din LAM-M7 au pozitivitate focala distincta partial inhibata de NaF.   Eritroblastii din LAM-M6 au de obicei activitate ANAE pozitiva, neinhibata de NaF.

Celulele blastice din LAL sunt negative;  foarte rar pot aparea celule ANAE slab pozitive cu aspect granular, cu sensibilitate variabila la NaF^1;4.

Bibliografie

1. Dan Colita. Tratat de Medicina Interna-Hematologie, partea a II-a (sub redactia Radu Paun), ed 1999, 1014-1026.
2. Lothar Thomas. Hematology. In Clinical Laboratory Diagnostics, ed 1998, 520.
3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog;
4. Marsha C.Kinney, John N.Lukens. Classification and differentiation of the acute leukemias. In Wintrobe’s Clinical Hematology, Philadelphia ed. 1999, 2211-2220.
5. Shafer J, Canadian Society of Laboratory Technologist Congress, Winnipeg, Manitoba, June 16 to 20, 1996, Workshop Manual, p 167-176.
6. Sherrie L. Perkins. Cytochemical Stains. In Wintrobe’s Clinical Hematology, Philadelphia ed. 1999, 26-27.