Laborator Synevo
Utilitatea testului
Acest test este util pentru a confirma prezenta anticorpilor IgG specifici fata de virusul hepatitei C in probele de ser care au dat rezultate reactive (pozitive) la testele screening anti-HCV (efectuate prin tehnici ELISA sau similare acestora). Este folosit mai ales in bancile de sange. Spre deosebire de testele screening, testul de confirmare permite, prin separarea electroforetica a antigenelor, o detectare a anticorpilor asociati cu diferite etape ale infectiei1;2;3;4;5.
Datorita imbunatatirii performantei testelor screening si dezvoltarii tehnicilor moleculare testul de confirmare este din ce in ce mai mult rezervat cazurilor in care s-au obtinut rezultate slab pozitive la etapa de screening1;3.
Pregatire pacient – preferabil à jeun (pe nemancate)4.
Specimen recoltat – sange venos4.
Recipient de recoltare – vacutainer fara anticoagulant cu/fara gel separator4.
Prelucrare necesara dupa recoltare – se separa serul prin centrifugare in ziua recoltarii4.
Volum proba – minim 2 mL ser4.
Cauze de respingere a probei – specimen intens hemolizat; specimen contaminat bacterian4.
Stabilitate proba – serul este stabil 6 zile in conditii ambientale; 7 zile la 2-8°C; timp indelungat la -20°C; evitati decongelarea/recongelarea repetata4.
Metoda – Imunoblot
Testul utilizeaza 5 antigene HCV recombinate purificate, relevante serologic, care sunt separate pe baza greutatii moleculare prin electroforeza in gel de poliacrilamida in prezenta de sodium dodecil sulfat (SDS-PAGE) si transferate ulterior electroforetic pe o membrana de nitroceluloza (Western blotting). Situsurile de legare libere de pe membrana sunt saturate cu o solutie de proteine, dupa care matricea este spalata si taiata in fasii (strip-uri). Antigenele sunt reprezentate, in ordinea fixarii pe strip, de:
–NS-3: proteina non-structurala cu activitate de helicaza virala si proteaza;
–Helicaza: proteina non-structurala/parte din NS3 cu activitate de helicaza virala;
–NS-5-12: proteina non-structurala/parte din NS5 (ARN polimeraza);
–NS-4: proteina non-structurala/partea N-terminala a NS4 cu functie neprecizata;
–Core: proteina structurala care formeaza cea mai mare parte a nucleocapsidei virale.
Intr-o prima etapa strip-ul incarcat cu antigenele HCV este incubat impreuna cu serul diluat al pacientului. Daca in ser sunt prezenti anticorpi specifici acestia se vor lega de antigenele corespunzatoare de pe strip. Dupa o etapa de spalare, strip-ul este incubat cu un conjugat anti-IgG uman marcat cu peroxidaza. Conjugatul se va atasa la portiunea IgG a complexului antigen-anticorp. Dupa indepartarea prin spalare a conjugatului nelegat se adauga solutia de colorare – un sistem de detectie enzimatica colorimetrica care contine peroxid de hidrogen si 4-cloro-1-naftol. Daca este prezent conjugatul legat reactia enzimatica va genera un produs colorat albastru-inchis la nivelul benzilor ocupate de anticorpi specifici. Astfel, benzile vizualizate la nivelul stripului sunt rezultatul legarii de anticorpilor specifici de antigenele individuale recombinate de la nivelul strip-ului4.
Valori de referinta si interpretarea rezultatelor
Intensitatea benzilor probelor este comparata cu cea a benzii antigenului core a controlului slab pozitiv inclus obligatoriu la fiecare rulare. Sunt posibile urmatoarele exprimari semicantitative
|
Intensitate banda |
Exprimare rezultat |
|
Absenta |
– |
|
Intensitate mai mica decat cea a benzii core a controlului slab pozitiv |
+/- |
|
Intensitate comparabila cu cea a benzii core a controlului slab pozitiv |
+ |
|
Intensitate mai mare decat cea a benzii core a controlului slab pozitiv |
++ |
Interpretarea definitiva a rezultatelor testului se face cu ajutorul unui software (dupa scanarea strip-urilor) care in functie de intensitate (de la +/- la ++) acorda un punctaj pentru fiecare banda a strip-ului, astfel:
|
Antigen HCV |
+/- |
+ sau ++ |
|
NS3 |
0 |
3 |
|
Helicaza |
0 |
3 |
|
NS-5-12 |
0 |
2 |
|
NS4 |
0 |
4 |
|
Core |
5 |
8 |
In final este calculata suma punctelor acordate si se va genera rezultatul testului4:
|
Suma punctelor |
Rezultat test Imunoblot |
|
≤ 5 |
Negativ |
|
6-9 |
Echivoc |
|
≥ 10 |
Pozitiv |
Un rezultat pozitiv confirma prezenta anticorpilor specifici anti-HCV datorati unei infectii in antecedente sau cronice.
Un rezultat echivoc indica faptul ca prezenta anticorpilor anti-HCV este incerta; testul trebuie repetat la un interval de 1-2 luni pentru a determina statusul definitiv anti-HCV. Sunt posibile urmatoarele situatii in cazul unui rezultat echivoc:
-reactivitate specifica in cursul fazei de seroconversie (la repetarea testului se va obtine un rezultat pozitiv);
-productia limitata a unui anticorp specific la pacienti imunodeprimati;
-reactivitate nespecifica.
Rezultatele echivoce trebuie interpretate in contextul clinic si epidemiologic al pacientului (existenta factorilor de risc pentru infectia HCV). La pacientii imunodeprimati cu risc crescut de a dezvolta infectie dar care prezinta un rezultat echivoc la testul de confirmare se indica ARN viral hepatita C.
Un rezultat negativ indica absenta anticorpilor specifici anti-HCV si un rezultat fals-pozitiv la testele screening1;2;3.
Analiza raspunsului imun dupa o infectie HCV recenta indica faptul ca anticorpii fata de NS3 si antigenul core apar in mod obisnuit cu cateva saptamani inaintea anticorpilor anti- NS4 si NS5. In timp ce anticorpii anti-NS3 sunt aproape intotdeauna detectabili, anticorpii fata de antigenul core pot fi initial absenti, in special in cazul infectiilor auto-limitante sau asimptomatice, si la aproximativ o treime din pacienti nu apar decat in faza cronica.
In infectia HCV cronica apare de obicei intreaga paleta de anticorpi. Cu toate acestea, intensitatea benzilor variaza semnificativ in decursul infectiei. In eventualitatea unui spectru incomplet de benzi, care este intalnit in special la pacientii imunodeprimati, anticorpii anti-NS4 si anti-NS5 sunt in mod obisnuit absenti.
Dupa vindecarea infectiei HCV anticorpii specifici dispar de obicei in decurs de cativa ani; anticorpii fata de antigenul core persista cel mai mult2.
Limite si interferente
O banda NS4 izolata reprezinta cel mai adesea o reactie nespecifica. Benzi NS3 sau NS4 izolate pot fi depistate in serul unor pacienti carora li s-a administrat sange sau alte derivate2.
Bibliografie
- ARUP Laboratories. Test Directory. Hepatitis C Virus Antibody, RIBA. www.aruplab.com. Ref Type: Internet Communication, 2010.
- Gert Frösner. Viral hepatitis. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. Lothar Thomas. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany,1 ed. 1998, 1275-1276.
- Guidelines for Laboratory Testing and Result Reporting of Antibody to Hepatitis C Virus. CDC. Morbidity and Mortality Weekly Report; February 7, 2003 / Vol. 52 / No. RR-3.
- Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog