Anticorpi anti-citoplasma neutrofile imunofluorescenta

Laborator Synevo

Informatii generale

Anticorpii ANCA au fost descrisi pentru prima data in 1982 la pacienti cu glomerulonefrita de natura autoimuna.

ANCA sunt  anticorpi (de tip IgG, mai rar IgA si IgM) indreptati in principal impotriva antigenelor din citoplasma granulocitelor neutrofile (tintele moleculare fiind enzimele din granulatiile primare sau azurofile ale granulocitelor neutrofile) si monocitelor^1;4;5.

Utilizand ca substrat neutrofile fixate cu etanol, la examenul prin imunofluorescenta indirecta au fost descrise 3 pattern-uri principale:

• citoplasmatic (c-ANCA), caracterizat prin fluorescenta granulara citoplasmatica difuza, cu accentuare centrala interlobulara; antigenul este reprezentat de proteinaza 3 (PR3), un component atat al granulatiilor azurofile din celulele mieloide, cat si al lizozomilor monocitari;
• perinuclear (p-ANCA), caracterizat prin fluorescenta perinucleara (inelara) omogena, fara fluorescenta citoplasmatica; principalul antigen estemieloperoxidaza (MPO), o proteina a granulatiilor neutrofile implicata in procese metabolice cum ar fi generarea de radicali de oxigen. Acest pattern apare datorita migrarii antigenelor incarcate pozitiv (cationice) in timpul fixarii cu etanol spre membrana nucleara care este incarcata negativ. Atunci cand in loc de etanol se utilizeaza formalina pentru fixarea neutrofilelor, antigenul tinta este imobilizat si se obtine o fluorescenta citoplasmatica.
• atipic ANCA (x-ANCA),  caracterizat prin fluorescenta perinucleara neomogena; antigenele implicate sunt catepsina G, elastaza, lactoferina, catalaza, enolaza, lizozimul, BPI (proteina bacterida care creste permeabilitatea) sau alte antigene necunoscute. Spre deosebire de aspectul p-ANCA tipic, atunci cand in loc de etanol se utilizeaza formalina pentru fixarea neutrofilelor nu se obtine fluorescenta⁴.

Au mai fost descrisi anticorpii GS-ANA (granulocyte-specific ANA = anticorpi anti-nucleari specifici granulocitelor) care produc o fluorescenta nucleara sau perinucleara pe substratul fixat cu etanol, dar negativa pe substrat Hep-2 si care apar la 20% dintre pacientii cu artrita reumatoida (prezenta lor ar putea fi determinata de ingestia complexelor imune de catre neutrofile, antigenul tinta nefiind inca identificat)¹.

Anticorpii ANCA se depisteaza predominant la pacientii cu vasculita sistemica pauciimuna, caracterizata histologic prin necroza fibrinoida prezenta in peretii venulelor, capilarelor si arteriolelor. Spre deosebire de vasculita mediata prin complexe imune, in vasculitele asociate cu ANCA lipsesc depozitele de complexe imune din peretele vascular, fiind prezente in schimb, mai ales in stadiile precoce de boala, polimorfonucleare. Afectarea endoteliului vascular, indusa de neutrofile, detine de asemenea un rol important in patogenia vasculitelor pauciimune.

Anticorpii c-ANCA se asociaza in mod specific cu boala Wegener. In cazul unei boli active cu vasculita sistemica, glomerulonefrita necrotizanta si inflamatie de tip granulomatos a tractului respirator, sensibilitatea clinica a c-ANCA este de 85-90%.

In lipsa afectarii renale sensibilitatea clinica este de numai 75%. Titrul anticorpilor c-ANCA se coreleaza cu gradul de activitate a bolii; dupa terapia imunosupresoare titrul anticorpilor scade foarte mult sau se obtine un rezultat negativ. c-ANCA mai pot aparea in poliangeita microscopica si in sindromul Churg-Strauss, insa cu o prevalenta redusa (45% si, respectiv, 10%).

Anticorpii p-ANCA apar tipic in glomerulonefrita rapid progresiva idiopatica, sindromul Churg-Strauss, poliangeita microscopica si panarterita nodoasa clasica (sensibilitate clinica de 65%, 60%, 45% si respectiv 15%). Peste 90% din cazurile confirmate bioptic de glomerulonefrita necrotizanta pauciimuna sunt p-ANCA pozitive. p-ANCA se mai depisteaza sporadic la unii pacienti cu o anumita forma de sclerodermie, caracterizata prin hemoragie pulmonara si insuficienta renala normotensiva^3;5.

Anticorpii x-ANCA se asociaza cu hepatitele autoimune, colangita sclerozanta primitiva, bolile inflamatorii intestinale (colita ulceroasa si boala Crohn), sindromul Felty^1;5. Majoritatea pacientilor adulti cu colita ulceroasa prezinta anticorpi p-ANCA ce sunt sensibili la DNA-aza, proprietate ce poate ajuta in diagnosticul diferential al anticorpilor p-ANCA din bolile inflamatorii de cei din hepatita autoimuna si colangita sclerozanta⁴.

Ghidurile internationale (International Consensus Statement) recomanda  testarea si raportarea ANCA utilizand metoda imunofluorescentei indirecte in combinatie cu metoda imunoenzimatica care detecteaza specificitatile ANCA pentru MPO si PR3. Deseori, sub presiunea optimizarii costurilor, screening-ul este realizat prin imunofluorescenta  si este urmat de metoda imunoenzimatica numai daca  rezultatul este pozitiv. O inalta  sensibilitate diagnostica pentru anticorpii ANCA este dobandita atunci cand se utilizeaza simultan, din start, imunofluorescenta si metoda imunoenzimatica. Acest lucru poate fi posibil utilizand o combinatie de neutrofile fixate cu etanol, neutrofile fixate cu formalina, substrat Hep-2, ficat de primate si spoturi tip microdrops cu amprente antigenice unice (MPO si PR3) in acelasi camp de incubatie. Astfel este posibila prediferentierea autoanticorpilor prin compararea pattern-urilor fluorescente, iar acestea se pot confirma reciproc. Prin combinarea substraturilor conventionale cu amprentele antigenice definite anti-MPO si anti-PR3, rezultatul testului de screening poate fi confirmat direct.

Neutrofilele fixate cu etanol reprezinta substratul standard pentru anticorpii ANCA. Formalina previne migrarea antigenelor neutrofile din citoplasma catre membrana nucleara si distruge antigenele nucleare. Pe substratul fixat cu etanol, antigenele neutrofile citoplasmatice sunt incarcate pozitiv si migreaza spre membrana nucleara incarcata negativ, rezultand un pattern p-ANCA. Daca neutrofilele sunt tratate cu formalina, se realizeaza legaturi covalente intre proteine, migrarea este oprita si antigenele  raman in citoplasma. Astfel, probele avand un aspect p-ANCA pe substratul fixat cu etanol  prezinta un aspect c-ANCA pe substratul fixat cu formalina, in timp ce probele ANA pozitive devin negative sau isi reduc intensitatea cand sunt trecute pe substratul fixat cu formalina. Frecvent, probele pacientilor sunt pozitive atat pentru anticorpii ANCA, cat si pentru  anticorpii ANA. Anticorpii ANA  pot mima pattern-ul p-ANCA pe substratul fixat pe etanol, de aceea este necesar sa se faca distinctia intre pattern-urile c-ANCA si p-ANCA adevarate de cele non-ANCA (fals-pozitive)².

Recomandari pentru determinarea anticorpilor ANCA (conditii clinice asociate)

• glomerulonefrita (in special forma rapid progresiva);
• hemoragie pulmonara;
• vasculita cutanata cu manifestari sistemice;
• noduli pulmonari multipli;
• afectiuni cronice distructive ale cailor respiratorii superioare;
• sinuzita sau otita cu evolutie indelungata;
• stenoza traheala subglotica;
• mononevrita multiplex sau alte neuropatii periferice;
• masa retroorbitara;
• boli inflamatorii de cauza neprecizata⁵.

Pregatire pacient – à jeun (pe nemancate) sau postprandial (dupa mese)². 

Specimen recoltat – sange venos².

Recipient de recoltare – vacutainer fara anticoagulant cu/fara gel separator².

Prelucrare necesara dupa recoltare – se separa serul prin centrifugare².

Volum proba – minim 2 mL ser².

Cauze de respingere a probei – ser intens hemolizat, lipemic sau puternic contaminat bacterian².

Stabilitate proba – serul separat este stabil 7 zile la 4°C; timp mai indelungat la -20°C³.

Metoda – imunofluorescenta indirecta².

Valori de referinta, comunicarea rezultatelor si interpretarea rezultatelor

<1/10: Negativ

In cazul unui rezultat pozitiv se va comunica titrul precum si aspectul c-ANCA, p-ANCA sau x-ANCA.

Vor fi exclusi obligatoriu anticorpii ANA care mimeaza p-ANCA.

Aspectele c-ANCA si p-ANCA trebuie confirmate prin teste imunoenzimatice².

Limite si interferente 

Testul ANCA nu trebuie utilizat ca test screening la persoane asimptomatice.

Deciziile clinice nu trebuie sa se bazeze pe un singur rezultat ANCA pozitiv.

In afara afectiunilor mentionate mai sus anticorpii ANCA mai pot fi intalniti si in alte conditii clinice, cum ar fi: lupus eritematos sistemic, lupus eritematos indus medicamentos, sindrom Sjögren, polimiozita si dermatomiozita, artrita reumatoida, artrita reactiva, sindrom antifosfolipidic, sindroame mielodisplazice, infectia HIV, endocardita bacteriana subacuta, cromomicoza, ameobiaza invaziva, fibroza chistica, precum si in anumite neoplazii⁴. 

Bibliografie

1. A. R. Bradwell, R.P. Stokes, G. D. Johnson. Atlas of Autoantibody Patterns on Tissues, 1997, 95-97.
2. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog
3. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide. Antineutrophil Cytoplasmic Antibodies (ANCA). www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.
4. Rex M. McCallum, David J. Bylund. Vasculitis. In In Henry´S.Clinical Diagnosis and Management By Laboratory Methods, Ed.Saunders, 2007, 933-943.
5. Werner J. Mayet. Autoantibodies in Systemic Vasculitis. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. Lothar Thomas. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany,1 ed. 1998, 842-845.