Laborator Synevo
Informatii generale
Virusul hepatitei E (HEV), recent inclus in genul Hepevirus al familiei Hepeviridae, cauzeaza o infectie acuta, de obicei, autolimitanta. Este un virus sferic, lipsit de invelis, cu diametru de 27-34 nm, alcatuit dintr-un genom ARN monocatenar cu polaritate pozitiva. Sunt descrise 4 genotipuri majore si un singur serotip. Genomul prezinta 3 cadre de citire (open reading frames = ORF): ORF1 codifica metiltransferaza, proteaza, helicaza si replicaza; ORF 2 codifica proteina capsidei; ORF3 codifica o proteina a carei functie nu a fost definita4.
HEV se transmite pe cale fecal-orala; consumul de apa potabila contaminata cu fecale este responsabil de aparitia majoritatii epidemiilor. Transmiterea directa de la o persoana la alta este neobisnuita. Transmiterea pe cale sexuala sau prin transfuzii nu a fost dovedita1;4.
Hepatita cu virus hepatitic E este endemica in Asia de sud-est si centrala, cu mai multe focare in Orientul Mijlociu, Africa de nord si de vest si Mexic, datorita conditiilor de igiena deficitara. In tarile dezvoltate infectiile HEV apar in special la persoanele care au calatorit in zonele unde boala este endemica.
Recent au fost descrise in tarile industrializate cazuri de infectii HEV sporadice, in absenta calatoriilor in strainatate, adesea cu evolutie subclinica sau asimptomatica. Majoritatea acestor cazuri denumite “autohtone” sunt asociate cu genotipul 3 HEV care prezinta o omologie marcata a secventelor cu genotipul 3 izolat de la porcine. Se ia astfel in considerarea posibilitatea unor infectii zoonotice transmise de la porcine sau alte animale. Cazurile severe apar la adultii tineri sau de varsta mijlocie (3%), dar mortalitatea este scazuta, cu exceptia femeilor gravide infectate in ultimul trimestru de sarcina (mortalitate aproximativ 20%).
Tabloul clinic este asemanator celui din hepatita A. Dupa o perioada de incubatie ce dureaza intre 15 si 60 de zile, pacientii infectati cu HEV dezvolta semne si simptome de hepatita (febra, hepatomegalie, cresterea moderata a transaminazelor), cu aparitia anticorpilor anti-HEV de tip IgM in ser, urmate de nivele detectabile de anticorpi anti-HEV IgG in termen de cateva zile. Anticorpii anti-HEV IgM pot ramane pozitivi pana la 6 luni de la debutul simptomelor, in timp ce anticorpii de tip IgG persista, de obicei, ani de la infectie. Viremia si excretia virusului in fecale apar in faza preicterica si continua si in faza clinica. Urmarirea pe termen indelungat a pacientilor cu hepatita E acuta a infirmat posibilitatea cronicizarii infectiei si existenta starii de carrier1;2;3.
Recomandari pentru determinarea HEV:
-detectarea infectiei recente cu virus hepatitic E;
-monitorizarea pacientilor postinfectie3.
Pregatire pacient – preferabil à jeun (pe nemancate)1.
Specimen recoltat – sange venos1.
Recipient de recoltare – vacutainer fara anticoagulant cu/fara gel separator1.
Prelucrare necesara dupa recoltare – se separa serul prin centrifugare in ziua recoltarii1.
Volum proba – minim 2 mL ser1.
Cauze de respingere a probei – specimen intens hemolizat; specimen contaminat bacterian1.
Stabilitate proba – serul este stabil 6 zile in conditii ambientale; 7 zile la 2-8°C; timp indelungat la -20°C; evitati decongelarea/recongelarea repetata1.
Metoda – Imunoblot
Testul utilizeaza antigene recombinate purificate, relevante serologic, care sunt separate pe baza greutatii moleculare prin electroforeza in gel de poliacrilamida in prezenta de sodium dodecil sulfat (SDS-PAGE) si transferate ulterior electroforetic pe o membrana de nitroceluloza (Western blotting). Situsurile de legare libere de pe membrana sunt saturate cu o solutie de proteine, dupa care matricea este spalata si taiata in fasii (strip-uri). Sunt detectati separat anticorpii de tip IgG si IgM. Selectarea proteinelor omoloage de la doua genotipuri diferite (genotipul 1 si 3) asigura o sensibilitate inalta chiar si pentru cazurile de infectie provenite din zonele non-endemice (“autohtone”). Testul detecteaza cele 4 genotipuri HEV si poate fi folosit atat pentru screening-ul cat si pentru confirmarea infectiei.
Antigenele sunt reprezentate, in ordinea fixarii pe strip, de:
–O2N: portiunea N-terminala a proteinei ORF2;
–O2C: portiunea C-terminala a proteinei ORF2;
–O2M: portiunea mijlocie a proteinei ORF2;
–O3: proteina ORF3.
Intr-o prima etapa strip-ul incarcat cu antigenele HEV este incubat impreuna cu serul diluat al pacientului. Dupa o etapa de spalare, strip-ul este incubat, in functie de clasa de anticorpi testata, cu un conjugat anti-IgG sau anti-IgM uman marcat cu peroxidaza. Conjugatul se va atasa la complexul antigen-anticorp format. Dupa indepartarea prin spalare a conjugatului nelegat se adauga solutia de colorare – un sistem de detectie enzimatica colorimetrica care contine peroxid de hidrogen. Daca este prezent conjugatul legat, reactia enzimatica va genera un produs colorat albastru-inchis la nivelul benzilor ocupate de anticorpii specifici. Astfel, benzile vizualizate sunt rezultatul legarii anticorpilor specifici de antigenele individuale recombinate de la nivelul strip-ului1.
Valori de referinta si interpretarea rezultatelor
Fiecare strip contine in partea superioara o banda de control care reprezinta controlul reactiei necesar pentru a confirma efectuarea corecta a testului.
Intensitatea benzilor probelor este comparata cu cea a benzii O2C a controlului slab pozitiv inclus obligatoriu la fiecare rulare. Sunt posibile urmatoarele exprimari semicantitative:
|
Intensitate banda |
Exprimare rezultat |
|
Absenta |
– |
|
Intensitate mai mica decat cea a benzii O2C a controlului slab pozitiv |
+/- |
|
Intensitate comparabila cu cea a benzii O2C a controlului slab pozitiv |
+ |
|
Intensitate mai mare decat cea benzii O2C a controlului slab pozitiv |
++ |
Interpretarea definitiva a rezultatelor testului se face cu ajutorul unui software (dupa scanarea strip-urilor) care in functie de intensitate (de la – la ++) acorda un punctaj pentru fiecare banda a strip-ului de la 0 la 3.
In final este calculata suma punctelor acordate si se va genera rezultatul testului1:
|
Suma punctelor |
Rezultat test Imunoblot IgG |
|
<3 |
Negativ |
|
3 |
Echivoc |
|
>3 |
Pozitiv |
|
Suma punctelor |
Rezultat test Imunoblot IgM |
|
<5 |
Negativ |
|
5 |
Echivoc |
|
>5 |
Pozitiv |
Obtinerea unui rezultat pozitiv pentru anticorpii anti-HEV de tip IgM confirma diagnosticul de infectie recenta (in ultimele 6 luni).
Obtinerea unui rezultat pozitiv pentru anticorpii anti-HEV de tip IgG indica o infectie in antecedente sau o infectie acuta in faza de covalescenta.
In cursul infectiei acute se inregistreaza o reactivitate a anticorpilor anti-HEV IgG cu toate componentele proteice ORF2 si ORF3. Intensitatile benzilor O2N si O3 scad in timp, insa intensitatea benzii O2C creste progresiv, astfel ca in cazul infectiilor vechi anti-HEV IgG sunt indreptati in principal asupra portiunii C-terminale a proteinei ORF23.
Limite si interferente
Obtinerea unui rezultat negativ pentru anticorpii anti-HEV de tip IgM nu exclude intotdeauna o infectie recenta (in ultimele 6 luni) deoarece acestia sunt prezenti in medie 6-7 saptamani de la debutul infectiei (dar nu mai mult de 6 luni) la aproximativ 80% din pacientii infectati. La restul bolnavilor diagnosticul este stabilit in urma detectiei ARN viral in ser sau materii fecale.
In unele cazuri anticorpii anti-HEV de tip IgG apar la 2-4 saptamani de la debutul clinic si de aceea testarea trebuie repetata pentru confirmarea prezentei anticorpilor specifici2;3.
Bibliografie
- Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog
2.Lothar Thomas. Hepatitis E. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1 Ed., 1998,1282-1284.
3.Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. Hepatitis E Antibody, IgM, IgG , Serum. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
4.Panda SK, Thakral SA, Rehman S. Hepatitis E virus. In Rev Med Virol 2007, 17(3):151-180.