Laboratorul Synevo
Informatii generale si recomandari ale genotiparii HBV
Virusul hepatitei B, un virus ADN, este membru al familiei Hepadnaviridae care se replica prin revers-transcrierea ARN-ului pregenomic incapsidat cu ajutorul polimerazei virale. Polimeraza nu prezinta capacitate de “corectare a erorilor de citire” aparute la transcriere astfel ca heterogenitatea secventelor este o caracteristica a HBV.
Analiza secventelor ADN a genomului viral a condus la identificarea a 4 gene diferite, denumite C, S, P si X care codifica AgHBc/HBe, AgHBs, polimeraza si respectiv proteinele HBx. Expresia acestor gene este reglata de catre 4 promotori (S1p, S2p, Cp si Xp) si 2 intensificatori (enhancer I, II)4.
Analiza filogenetica a condus la clasificarea HBV in 8 genotipuri care difera unul de celalalt in proportie de >8% la nivelul secventelor nucleotidice ale intregului genom si in proportie de >4% la nivelul genei S. De la prima descriere ale celor 4 genotipuri (A-D) in 1988, au mai fost identificate inca 4 (E-H). In plus, in cadrul genotipurilor A, B, C si F au fost descrise subgenotipuri care difera intre ele in proportie de >4%.
Cele 8 genotipuri prezinta o distributie geografica distincta. Genotipul A este prevalent in nord-vestul Europei, America de Nord si Africa, genotipurile B si C predomina in Asia, genotipul D are o distributie ubicuitara, dar predomina in zona mediteraneeana. Genotipul E este intalnit in Africa, genotipul F la populatiile aborigene din America de Sud, iar genotipul H este limitat la populatiile amerindiene din America Centrala. Distributia genotipului G sa este mai putin clara1;4.
Prima evidenta a faptului ca proprietatile biologice ale HBV difera in functie de genotip a fost observatia ca mutatia ce introduce un codon stop prematur in pozitia 1896 a regiunii pre-core este intalnita frecvent in regiunile in care predomina genotipul D si este absenta in regiunile cu genotipul A. Ulterior, s-a constatat ca heterogenitatea in distributia globala a genotipurilor HBV este responsabila nu numai de diferentele in prevalenta mutatiilor HBV in diferite populatii, ci si de diferentele in evolutia clinica a infectiei HBV si in raspunsul la tratamentul antiviral.
Legatura dintre mutatiile HBV si genotipuri
Regiunea precore-core a genomului HBV codifica proteina de fuziune precore-core care este modificata post-translational pentru a da nastere AgHBe. Functia exacta a AgHBe nu este bine cunoscuta; se crede ca detine un rol in imunomodulare si poate altera raspunsul gazdei la proteina core. Astfel, dezvoltarea mutatiei Stop Codon 1896 G>A care impiedica exprimarea AgHBe ar reprezenta un mecanism de evaziune imuna. Aparitia mutatiei 1896 este restrictionata de catre structura secundara a proteinei є asociata cu semnalul de incapsidare si codificata de aceeasi regiune a genomului HBV ca si AgHBe. Destabilizarea acestei structuri prin dislocarea perechii de baze C-G intre codonii 1858 si 1896 (care ar rezulta ca urmare a mutatiei G>A in pozitia 1896) ar fi in detrimentul replicarii. Din acest motiv dezvoltarea mutatiei 1896 depinde de prezenta sau absenta unei baze C sau T in pozitia 1858 si prezinta o variatie geografica ce poate fi corelata cu distributia genotipurilor (vezi figura 18.3.7.1). Genotipurile B, D si E prezinta T1858, in timp ce genotipurile A si H au C1858.
Genotipurile C si F pot avea fie T1858, fie C1858 : tulpinile avand genotipul F din America Centrala ca si tulpinile avand genotipul C din Japonia se caracterizeaza exclusiv prin T1858 , in timp ce C1858 este limitat la purtatorii genotipului C din sud-estul Asiei. In concluzie, mutatia 1896 este intalnita mai frecvent la pacientii anti-HBe pozitivi infectati cu genotipul D si E, rareori in asociere cu genotipul A si doar la o minoritate din pacientii purtatori ai genotipurilor C si F.
Mutatiile aparute in regiunea promotorului core (BCP = Basic Core-Promoter), transversia A>T in pozitia 1762, impreuna cu tranzitia G>A in pozitia 1764 (T1762A1764) au fost descrise initial la pacienti japonezi. Prezenta acestora precede seroconversia AgHBe in cazul genotipului A, dar nu si in cazul genotipului D; de asemenea sunt asociate cu niveluri scazute de ARNm precore si de expresie a AgHBe. S-a constatat o asociere semnificativa statistic a acestor mutatii cu afectare hepatica mai severa si varsta >35 ani.
Au fost descrise diferite mutatii in regiunea pre-S, de la mutatii punctiforme, deletii si insertii mici pana la deletii foarte mari. In doua studii independente s-a constatat ca variantele cu deletii pre-S sunt asociate mai frecvent cu genotipul B decat cu C. Dimpotriva, un alt studiu, desi a aratat ca mutatiile pre-S apar mai frecvent la purtatorii de genotip B si C in comparatie cu restul genotipurilor, nu a indicat o diferenta semnificativa statistic intre genotipurile B si C. Aceste variante sunt detectate cu frecventa mai mare la pacientii cu afectiuni hepatice severe (ciroza sau carcinom hepatocelular), deoarece pot afecta clearance-ul viral si contribui la cronicitatea infectiei.
Sunt descrise si variante HBV care rezulta din incapsidarea si revers-transcrierea ARN-ului pregenomic care a suferit splicing-ul – “splice variants”. Studiile au aratat ca nu exista nici o diferenta intre variantele dominante de splicing produse de genotipurile D, C si E, in timp ce variantele minore de splicing sintetizate de izolatele care apartin diverselor genotipuri sunt diferite. Splicing-ul poate contribui la patogenicitatea si/sau persistenta virusului.
Legatura dintre progresia bolii si genotipuri
Deoarece progresia bolii este influentata de mai multi factori, cum ar fi varsta la care fost contractata infectia, calea de transmitere, competenta imuna a gazdei si factorii de mediu (consumul de alcool, supraincarcarea cu fier si expunerea la aflatoxina), interpretarea rolului exercitat de genotipuri trebuie sa se faca cu multa atentie.
Majoritatea studiilor asupra efectului genotipurilor HBV asupra progresiei bolii au fost efectuate in sud-estul Asiei unde HBV este hiperendemic si predomina genotipurile B si C.
Pacientii infectati cu genotipul B au o sansa mai mare de a prezenta remisiune biochimica sustinuta dupa seroconversia AgHBe spontana decat cei infectati cu genotipul C. Genotipul C este mai prevalent la pacientii cu fibroza sau ciroza si este asociat cu o afectare histologica a ficatului mai severa in comparatie cu genotipurile B sau D. Pacientii infectati cu genotipul C au scoruri mai mari de activitate necroinflamatorie si fibroza, precum si niveluri mai mari ale transaminazelor serice fata de cei infectati cu genotipurile B, A sau D.
In ceea ce priveste carcinomul hepatocelular este nevoie de studii longitudinale care sa stabileasca in ce masura genotipurile influenteaza incidenta bolii pe termen lung.
In Occident studiile privind impactul genotipurilor HBV asupra progresiei bolii sunt mai putin numeroase. In Europa s-a constatat ca evolutia pe termen lung a infectiei HBV este diferita in functie de genotipuri. Genotipul A a fost mai prevalent la pacientii cu hepatita cronica AgHBe pozitiva, in timp ce genotipul D a predominat la cei anti-HBe pozitivi. Pacientii avand genotipul D, fie ca au fost AgHBe pozitivi sau negativi, au prezentat valori mai mari ale incarcaturii virale, in comparatie cu genotipurile A, B si C. Prognosticul hepatitei cronice B ar fi mai bun la pacientii infectati cu genotipul A fata de cei cu genotipul D sau F, deoarece prezinta o rata mai mare de remisiune biochimica sustinuta si de reducere a viremiei. Genotipul D a fost asociat cu o afectiune recurenta severa post-transplant1.
Romania se situeaza in randul tarilor cu o prevalenta inalta a purtatorilor de AgHBs (16%). Intr-un studiu publicat recent care a inclus 130 pacienti, cu un spectru variat al infectiei HBV, s-a constatat ca genotipul D a avut prevalenta cea mai mare (66%) si a fost asociat cu infectie activa si evolutie spre carcinom hepatocelular. Genotipul A a fost corelat cu statusul de purtator inactiv al AgHBs, in timp ce infectia cronica indelungata a fost asociata in majoritatea cazurilor cu un amestec al genotipurilor A si D2.
Legatura dintre raspunsul la tratamentul antiviral si genotipuri
Intr-un studiu efectuat pe pacienti germani s-a constatat ca cei infectati cu genotipul A au o rata de seroconversie AgHBe mai mare sub tratmentul cu interferon decat cei cu genotipul D. Intr-un studiu desfasuart in Taiwan rata disparitiei AgHBe sub interferon a fost semnificativ mai mare la pacientii cu genotip B comparativ cu genotipul C.
In ceea ce priveste raspunsul la lamivudina, genotipul B este asociat cu un raspuns virusologic mai bun in comparatie cu genotipul C la pacientii din Taiwan. Cu toate acestea, ambele genotipuri prezinta un risc similar de dezvoltare a rezistentei la lamivudina dupa un an de terapie. Mutatiile asociate cu rezistenta la lamivudina se dezvolta mai lent in cazul genotipului D.
Intr-un studiu mare efectuat in Japonia rata de aparitie a rezistentei la lamivudina a fost independenta de genotipurile A, B si C. Pe de alta parte, rata a fost semnificativ mai mare la cei cu subgenotipul Ba decat la cei cu subgenotipul Bj. Acest studiu a sugerat de asemenea ca impactul pozitivitatii AgHBe asupra rezistentei la lamivudina difera in functie de genotipuri si ca riscul dezvoltarii unei hepatite severe este mai mare la pacientii infectati cu genotipul C1.
In concluzie, datele actuale indica din ce in ce mai evident faptul ca genotipul HBV are avea un rol predictiv asupra raspunsului la diferitele terapii antivirale si ca ar trebui luat in considerare ca o variabila inaintea initierii tratamentului1;2.
Pregatire pacient – nu este necesara o pregatire speciala3.
Specimen recoltat – sange venos3.
Recipient de recoltare – vacutainer ce contine EDTA ca anticoagulant3.
Cantitate recoltata – cat permite vacuumul3.
Cauze de respingere a probei – folosirea heparinei ca anticoagulant; probe coagulate sau hemolizate3.
Stabilitate proba – sangele EDTA este stabil 48h la 2-8ºC3.
Metoda – reactie de polimerizare in lant urmata de revers-hibridizare cu sonde oligonucleotidice specifice pe stripuri3.
Limite si interferente
Efectuarea genotiparii HBV nu este recomandata pentru screening-ul sau confirmarea infectiei HbV. Testul este posibil numai in cazul existentei unei viremii B > 1000 UI/mL3.
Bibliografie
- A. Kramvis, M.C.Kew. Relationship of Genotypes of Hepatitis B Virus to Mutations, Disease Progression and Response to Antiviral Therapy. In J Viral Hepat. 2005; 12(5): 456-464.
- Constantinescu I, Nedelcu F, Toader MA. Clical and Therapeutical Importance of HBV Genotyping in Romania. In J Med Life, 2008 Apr-June;1(2):165-73.
- Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2009. Ref Type: Catalog.
- Margaret James Koziel, Chloe Lynne Thio. Hepatitis B Virus and Hepatitis D Virus. In Mandell, Douglas, and
- Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th edition, Churchill Livingstone, Elsevier, 2010, 2059-2064.