Toxoplasma gondii ADN in LCR

Laborator Synevo

 

Informatii generale si recomandari

Toxoplasma gondii este un protozoar apartinand ordinului Coccidia, clasa Sporozoare, foarte apropiat de genul Isospora. Ciclul de viata al Toxoplasma presupune 3 forme:

-trofozoit: forma invaziva responsabila de manifestarile acute ale infectiei;

-chist: responsabil de infectia persistenta si  latenta;

-oochist: nu se intalneste la om, ci numai la pisica (gazda obligatorie), avand rol in ciclul evolutiv al Toxoplasmei si  in transmiterea infectiei⁷.

Parazitul este ubicuitar in natura, fiind intalnit in mod obisnuit in solurile din regiuni calde si umede ce sunt contaminate cu materii fecale de la animale. Parazitul poate infecta orice mamifer, insa principalul rezervor al bolii este reprezentat de familia Felidae (din care face parte si pisica), unde parazitul se reproduce si este eliminat prin materiile fecale sub forma de oochisti in cursul infectiei acute.

Infectia se transmite la om prin ingestia de carne cruda sau insuficient preparata termic ce contine chisturi tisulare, consumul de apa sau alimente contaminate cu oochisti sau vertical (transplacentar) de la o mama ce a dobandit infectia in cursul sarcinii. Mult mai rara este transmiterea printr-un transplant de organ infectat sau o transfuzie cu celule sangvine contaminate.

Receptivitatea fata de infectie este generala. Toxoplasma gondii se multiplica intracelular la locul de invazie (tractul gastrointestinal), iar bradizoitii eliberati din chisturile tisulare sau sporozoitii eliberati din oochisturi penetreaza si se multiplica in celulele epiteliale intestinale. Formele parazitare se propaga mai intai in ganglionii limfatici mezenterici dupa care ajung si la organe situate la distanta, pe cale limfatica sau sangvina. Toxoplasma infecteaza virtual toate tipurile celulare, insa exista o predilectie pentru neuroni, microglii, celulele coroidei si retinei, precum si  pentru celulele apartinand sistemului reticuloendotelial. O data cu dezvoltarea raspunsului imun umoral sau celular supravietuiesc doar acei paraziti care sunt protejati de un habitat intracelular sau se gasesc in interiorul chisturilor tisulare. Un raspuns imun eficient reduce semnificativ numarul tahizoitilor din toate tesuturile. Formarea chisturilor tisulare se produce in numeroase tesuturi si organe in cursul primei saptamani de infectie; acestea sunt responsabile de infectia reziduala (cronica sau latenta) si persista in principal la nivelul creierului, muschilor scheletici, miocardului si ochiului⁵.

Frecventa infectiei variaza dupa grupe de varsta si  populatie intre 20 si  80%, procentul crescand cu varsta, asa cum rezulta din prezenta testelor serologice pozitive, al caror procent creste cu varsta¹¹.

Sunt descrise 5 forme de toxoplasmoza:

-dobandita la un pacient imunocompetent;

-dobandita sau reactivata la un pacient imunodeprimat;

-oculara;

-toxoplasmoza la gravide;

-congenitala⁵.

La pacientii imunocompetenti infectia evolueaza in majoritatea cazurilor asimptomatic. Atunci cand infectia devine clinic manifesta, pacientul prezinta un sindrom mononucleozic autolimitant cu astenie fizica si  adenopatii. Pentru diagnosticul diferential al limfadenopatiilor pot fi utilizate testele serologice¹¹.  

Daca la persoanele normale evolutia toxoplasmozei este benigna, la pacientii imunodeprimati (neoplazii hematologice: boala Hodgkin si limfoamele non-hodgkiniene, transplant de organe, SIDA, corticoterapie de lunga durata, chimioterapie, terapia anti-TNF alfa) consecintele infectiei pot fi foarte grave, de aceea diagnosticul trebuie stabilit cat mai repede. Febra de cauza neprecizata poate fi singura manifestare a toxoplasmozei in stadiu precoce la aceasta categorie de pacienti. Encefalita, pneumonita si miocardita reflecta infectia activa a organelor cel mai frecvent afectate.

Encefalita indusa de T. gondii este cea mai frecventa forma de manifestare a toxoplasmozei si cauza cea mai comuna de leziuni SNC focale la pacientii cu SIDA. Pneumonita este frecventa si adesea omisa ca diagnostic. Infectia diseminata nu este neobisnuita, iar manifestarile clinice pot sa nu reflecte intotdeauna severitatea bolii. Mortalitatea se apropie de 100% in absenta tratamentului initiat precoce. Toxoplasmoza la imunodeprimati poate fi consecinta reactivarii unei infectii latente sau poate fi rezultatul unei infectii primare dobandite cel mai adesea prin transplantul unui organ infectat⁵.

La pacientii imunodeprimati rezultatele serologiei trebuie interpretate cu prudenta, deoarece acestia prezinta de obicei titruri scazute de anticorpi IgG, iar anticorpii IgM pot fi nedetectabili. Reactia de polimerizare in lant (PCR) care detecteaza T. gondii ADN (in special gena B1) in sange si diverse lichide biologice s-a dovedit a fi o metoda sensibila si specifica pentru diagnosticul infectiei la acesti pacienti. Astfel, pentru diagnosticul encefalitei toxoplasmozice cel mai util produs patologic este lichidul cefalo-rahidian (LCR), testul PCR avand o sensibilitate si o specificitate de 83.3%, respectiv 95.7%^8;9;12. Determinarea ADN-ului in sange este importanta pentru diagnosticul toxoplasmozei generalizate si mai putin pentru encefalita toxoplasmozica (in cazul infectiei SNC parazitemia este mai rar prezenta). Se pare ca tratamentul influenteaza sensibilitatea metodei PCR; sensibilitatea este mai mare daca probele de sange sau de LCR se recolteaza fie inainte, fie in prima saptamana de tratament^4;5;9;12.

Infectia oculara la pacientii imunocompetenti produce corioretinita acuta caracterizata prin inflamatie severa si necroza. La pacientii cu SIDA corioretinita se manifesta prin panoftalmita segmentara si zone de necroza de coagulare asociate cu chisturi tisulare si tahizoiti. In jurul vaselor retiniene trombozate pot fi vizualizate numeroase microorganisme; se pot produce leziuni multiple si bilaterale. Pacientii avand corioretinita activa indusa de Toxoplasma gondii nu prezinta de obicei anticorpi IgM detectabili, iar titrurile de anticorpi IgG sunt scazute. In majoritatea cazurilor corioretinita toxoplasmozica este diagnosticata prin examen oftalmologic. Cu toate acestea exista pacienti cu modificari atipice ale retinei; la acestia detectarea ADN-ului parazitului in umoarea apoasa sau in cea vitroasa confirma diagnosticul⁵.

Infectia acuta cu Toxoplasma este asimptomatica la majoritatea gravidelor. Cu toate acestea este importanta datorita posibilitatii transmiterii infectiei la fat. In cea mai mare parte a cazurilor transmiterea la fat este limitata la acele paciente care dobandesc infectia in cursul sarcinii. Exceptii rare au fost observate la unele femei imunocompetente care au fost infectate cu T. gondii cu putin timp inaintea conceptiei. Rareori transmiterea la fat se produce prin reactivarea unei infectii latente la gravide imunodeprimate infectate inaintea conceptiei (coinfectie HIV – T.gondii,  paciente cu LES sub corticoterapie). Pentru a evita complicatiile din cursul sarcinii se recomanda evaluarea statusului imun inainte de conceptie. Se considera astfel ca femeile seropozitive inainte de a ramane insarcinate sunt protejate in ceea ce priveste transmiterea infectiei viitorului fat. Pe de alta parte, femeile seronegative prezinta riscul de a contracta infectia in cursul sarcinii, iar la acestea trebuie aplicate masuri profilactice^2;5.

Infectia fetala in cursul primului trimestru de sarcina se produce mai rar, dar se asociaza cu un risc mai mare de avort spontan si aparitie a anomaliilor fetale. Infectia contractata intr-o perioada avansata a sarcinii este mai frecvent transmisa la fat, dar prezinta un risc mai mic de a induce anomalii  fetale. Cel mai mare risc de boala congenitala severa apare cand infectia este dobandita in saptamanile 10-24 de sarcina, iar cel mai mare risc de transmitere verticala se produce in cursul saptamanilor 26-40. Infectia primara a mamei imediat inaintea conceptiei sau in primele 10 saptamani de sarcina are o rata de transmitere verticala de 2%, dar peste 80% dintre fetusii infectati vor dezvolta o boala severa cu microftalmie, corioretinita, hidrocefalie si  calcificari intracraniene. Intre saptamanile 24 si  30 prevalenta infectiei severe scade de la 80 la 20%, iar dupa saptamana 30 se reduce la 6%, desi peste 80% dintre gravidele care prezinta infectie primara in aceasta perioada vor transmite infectia fatului. Efectuarea testului PCR din lichid amniotic reprezinta cea mai buna metoda de diagnostic a infectiei fetale¹. Astfel, la gravidele care prezinta seroconversie in cursul sarcinii studiile au indicat o sensibilitate de 83-97.5% si o specificitate de 100% in detectarea infectiei fetale. Amniocenteza va fi evitata la mamele HIV pozitive datorita riscului de transmitere a virusului la fat. La nou-nascutul cu suspiciune de toxoplasmoza congenitala se pot recolta probe de lichid cefalorahidian, urina sau sange periferic in vederea diagnosticului molecular^1;3;10.

Recomandari pentru determinarea Toxoplasma – ADN

• Toxoplasma – ADN in sange: diagnosticul toxoplasmozei diseminate si al infectiei neonatale^5;10.
• Toxoplasma – ADN in urina: detectarea infectiei congenitale³.
• Toxoplasma – ADN in LCR: diagnosticul encefalitei toxoplasmozice la pacienti imunodeprimati sau la nou-nascut^5;8;1_.
• Toxoplasma –  ADN in lichid amniotic: diagnosticul infectiei fetale cu T. gondii^1;10.
• Toxoplasma – ADN in lichid ocular (umoare apoasa sau vitroasa): detectarea corioretinitei toxoplasmozice⁵.

Pregatire pacient – nu este necesara⁶.

Specimen recoltat – a) sange venos; b) o proba de urina spontana; c) lichid cefalorahidian recoltat prin punctie lombara; d) lichid amniotic; e) umoare apoasa sau vitroasa⁶.

Recipient de recoltare – a) vacutainer ce contine EDTA ca anticoagulant; b) eprubeta pentru urina; c), d), e) recipient steril⁶.

Cantitate recoltata – a) cat permite vacuumul; b), c) si d)  minimum 2 mL; e) minimum 0.1 mL (optim 0.3 mL)⁶.

Prelucrare necesara dupa recoltare – probele nu vor fi centrifugate⁶.

Cauze de respingere a probei – a) probe vechi, coagulate, hemolizate; folosirea heparinei ca anticoagulant⁶.

Stabilitate proba – probele de sange, urina, LCR, lichid amniotic sau ocular sunt stabile 48 ore la 2-4°C inainte de extractia acizilor nucleici⁶.

Metoda – PCR cu detectie colorimetrica (test calitativ)⁶.

Valori de referinta – Toxoplasma gondii – ADN nedetectabil⁶.

Limita de detectie – 10 copii/mL⁶.

Interpretarea rezultatelor

Detectia Toxoplasma – ADN in diverse produse patologice sustine diagnosticul clinic de infectie datorata acestui parazit⁸.

Limite si interferente

Un rezultat negativ nu elimina posibilitatea unei infectii cu Toxoplasma gondii, in special la nivel SNC⁸. 

Bibliografie

1. Ann M. Gronowski. Prenatal Screening and Diagnosis of Congenital Infections. In Handbook of Clinical Laboratory Testing During Pregnancy, Humana Press, Totowa, New Jersey, 2004, 273-276.
2. Berrebi, W.E. Kobuch. Toxoplasmosis in pregnancy. In Lancet, 1994, 344, 950.
3. Isabel Fuentes, Mercedes Rodriguez. Urine Sample Used for Congenital Toxoplasmosis Diagnosis by PCR. Journal of Clinical Microbiology. 1996, 34 (10): 2368–2371.
4. J. Lamoril, J-M Molina. Detection by PCR of Toxoplasma gondii in blood in the diagnosis of cerebral toxoplasmosis in patients with AIDS. J Clin Pathol 1996; 49:89-92.
5. Jose G. Montoya, John C. Boothroyd, Joseph A. Kovacs. Toxoplasma gondii. In Mandell, Douglas, and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th edition, Churchill Livingstone, Elsevier, 2010, 3495-3516.
6. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.
7. Marin Voiculescu. Toxoplasmoza. In Boli infettioase-clinica si epidemiologie, Editura Medicala,1988, 1130-1139.
8. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: Toxoplasma gondii, Molecular Detection, PCR. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
9. Michel Dupon, Jean Cazenave. Detection of Toxoplasma gondii by PCR and Tissue Culture in Cerebrospinal Fluid and Blood of Human Immunodeficiency Virus-Seropositive Patients. Journal of Clinical Microbiology. 1995, 33 (9):2421–2426.
10. Nazan Dalgıc. Congenital Toxoplasma gondii infection. In Marmara Medical Journal 2008; 21(1);089-101.
11. P. Ambroise-Thomas, et al. Le toxoplasme et sa pathologie. Médecine et maladies infectieuses, 1993, 23 spécial, 121-128.
12. Yenisey Alfonso, Jorge Fraga. Molecular diagnosis of Toxoplasma gondii infection in cerebrospinal fluid from AIDS patients. In Cerebrospinal Fluid Research, 2009, 6:2.