Imunofenotipare limfocitara-autoimunitate

Laborator Synevo

 

Informatii generale

Mecanismele autoimunitatii

Afectiunile autoimune apar frecvent (afecteaza mai mult de 5% din indivizi), avand un impact semnificativ asupra morbiditatii si mortalitatii in populatia umana. Bolile autoimune sunt definite ca afectiuni in care raspunsul imun fata de anumite autoantigene sta la baza afectarii tisulare ce apare in aceste situatii.

Bolile autoimune pot fi atat specifice fata de un anumit tip de tesut (de exemplu, tiroida, celulele β pancreatice), cat si sistemice, afectand tesuturi multiple. Complexitatea acestor afectiuni este foarte mare, acestea avand implicatii genetice, fenotipice si kinetice. Adesea exista o perioada lunga de timp (saptamani sau luni) intre debutul simptomelor si aparitia fenotipului diagnostic, expresia bolii putand varia in timp la acelasi individ. In ciuda acestei complexitati exista o legatura stransa intre fenotipul clinic si tintele raspunsului autoimun, ceea ce a facut ca autoanticorpii sa fie folositi pentru diagnostic si prognostic (de exemplu, anticorpii anti-tiroid peroxidaza in tiroidita autoimuna, anticorpii anti-Sm pentru LES, anticorpii anti-topoizomeraza-1 in formele difuze de sclerodermie).

Raspunsul imun are caracterul imunitatii dobandite (care in mod normal este directionata impotriva antigenelor exogene) la care tinta este reprezentata de autoantigene. Substratul molecular este reprezentat de afectarea discriminarii intre self si nonself, mecanism ce poate fi mediat atat de anticorpi cat si de celulele T, dar asocierea frecventa cu  un anumit tip de HLA sugereaza ca in patogeneza acestor afectiuni este de obicei implicat mecanismul discriminarii self/nonself mediat de celulele T.

Etapele dezvoltarii autoimunitatii

Caracteristicele autoanticorpilor in afectiunile autoimune:

– unii anticorpi preced cu mult timp (ani) aparitia simptomelor (de exemplu, anticorpii antinucleari, antifosfolipidici si, in mai mica masura, anti-DNA in LES, anticorpii anti-CCP in artrita reumatoida);

– unii anticorpi apar cu putin timp inainte de debutul manifestarilor bolii (de exemplu, anti-Sm si anti-RNP in LES);

– in anumite situatii exista o asociere stransa intre autoanticorpii specifici si fenotipul clinic (de exemplu, anticorpii anti-topoizomeraza-1 sunt asociati cu sclerodermia difuza si boala pulmonara interstitiala).

Studiile efectuate cu privire la momentul aparitiei autoanticorpilor in LES fata de debutul simptomelor au dus la incadrarea lor in doua grupe, astfel: markeri de initiere a bolii (cei cu aparitie precoce) si markeri de propagere a bolii (cei asociati cu boala clinica).

Ca urmare, se considera ca boala autoimuna evolueaza in patru etape:

1. Susceptibilitatea – apare inaintea bolii si rezulta dintr-un complex de evenimente care vor permite ulterior manifestarea autoreactivitatii, prin afectarea echilibrului imun. Susceptibilitatea presupune urmatoarele mecanisme:

• inductia incompleta a tolerantei in timus fata de autoantigenele exprimate in periferie (de exemplu, deficitul de AIRE – “autoimun regulator” – reprezinta cauza sindromului poliendocrin autoimun tip I);
• afectarea mecanismelor de clearance a celulelor apoptotice si de producere a citokinelor anti-inflamatorii ce au ca rezultat inducerea tolerantei (de exemplu, deficitul de C1q, C4, MFG-E8, Mer);
• producerea defectiva a celulelor Treg (deficitul de FOXP3);
• alterarea mecanismelor de semnalizare imuna (de exemplu, polimorfismul CTLA-4, polimorfismul PTPN22).

Susceptibilitatea poate fi ereditara sau dobandita (in multe afectiuni se intalnesc ambele situatii), permanenta sau tranzitorie.

2. Initierea –  este marcata prin prezenta raspunsului autoimun care precede diagnosticul fenotipic clinic (de exemplu, anticorpii antifosfolipidici in LES). Se caracterizeaza prin concentratie crescuta de autoantigene, prezenta de structuri netolerate, existenta unui context proimun (infectii, malignitati, expunerea la adjuvanti).

Mecanisme care pot altera procesarea antigenelor ducand la expunerea unor epitopi criptici:

–  modificarea procesarii autoantigenelor prin cresterea afinitatii de legare fata de un ligand sau un anticorp;

– existenta unor mecanisme proteolitice distincte in timus si in periferie sau modificari diferentiale ale activitatii proteolitice;

– evenimente proteolitice noi care nu sunt prezente in mod normal la nivelul APC, de exemplu, clivaje noi ce apar in cursul proceselor de distructie/afectare celulara sau in inflamatie;

– forme noi de autoantigene rezultate prin mutatii, trunchieri sau splitari, modificari ce apar in cursul afectiunilor maligne (de exemplu, asocierea melanom-vitiligo sau aparitia afectiunilor neurologice paraneoplazice autoimune).

Inducerea autoimunitatii prin mimetism molecular

Conform acestei ipoteze, un anumit antigen – viral sau bacterian – prezinta importante similaritati cu structurile endogene. In cazul unei infectii cu un asemenea antigen, organismul va reactiona atat impotriva moleculelor straine cat si a celor endogene.

3. Propagarea – corespunde cu debutul bolii clinice si prezinta urmatoarele caracteristici: achizitia de proprietati adjuvante de catre autoantigenele tinta; cresterea expresiei autoantigenelor in tesutul afectat; caile efectoare ale imunitatii genereaza/expun autoantigene care intretin mai departe raspunsul imun (de exemplu, anti-Sm in LES).
4. Rezolutia – in multe cazuri are loc activarea mecanismelor imunoreglatorii (inca din faza de propagare a bolii) care vor stopa in mod natural evolutia bolii in timp².

Lupusul eritematos sistemic (LES)

LES este o afectiune autoimuna caracterizata prin productia de autoanticorpi si prin existenta unui spectru larg de manifestari clinice. Afecteaza mai ales femeile aflate in perioada fertila.

Urmatoarele elemente pot  contribui la  aparitia autoimunitatii:

– factorii genetici;

– pierderea tolerantei periferice prin anomalii la nivelul limfocitelor B,T si a celulelor dendritice;

– factori hormonali;

– factori de mediu.

Astfel, pe langa modificarile imunologice ce apar in LES, cum ar fi disfunctii ale sistemului complementului, modificarile de interactiune intre limfocitele B si T sau cele aparute in procesul de fagocitoza, hiperactivitatea celulelor B reprezinta o trasatura centrala a acestei boli. Prin urmare, studierea anomaliilor ce apar in biologia celulelor B este esentiala pentru descifrarea patogenezei in lupus. Au fost rapotate, de exemplu, secretia spontana de imunoglobuline de catre limfocitele periferice; expresia aberanta a unor receptori sau activarea cailor de semnalizare ce controleaza diferentierea si proliferarea celulelor B, productia de anticorpi si apoptoza; expresia anormala a unor factori – cum ar fi BAFF/BLyS, IL 10 si factorul solubil CD154 –  implicati in activarea si diferentierea celulelor B ce au fost identificati atat la pacientii cu LES cat si pe modelele animale¹.

Deoarece limfocitele joaca un rol impotant in raspunsul imun alterat din LES, determinarea diferitelor subpopulatii limfocitare este utila in monitorizarea activitatii bolii.

Celulele B CD19+/CD27++

CD27 este un marker util pentru diferentierea subseturilor de celule B din periferie. Astfel celulele B din periferie pot fi impartite in trei subgrupe: celule B naive (CD19+/CD27-), celule B de memorie (CD19+/ CD27+ sau CD19+/CD27 dim) si plasmocite (CD19+/ CD 27++ sau CD19+/ CD27 high). Plasmocitele prezinta nivele mai crescute ale CD27 decat celulele B de memorie. In mod special, procentul de plasmocite (CD19+/CD27++) este crescut la pacientii cu lupus, atat la copii cat si la adulti, corelandu-se pozitiv cu indexul de activitate al bolii (SLEDAI ≥ 8 ) si cu titrul de anticorpi anti-ADN dublu catenar. Cu toate acestea valori semnificativ crescute ale celulelor CD27high au fost observate si la pacientii anti-ADN dublu catenar negativi dar care erau pozitivi pentru alti autoanticorpi (anti-Sm, anti-La, anti-Ro, antihistone). In acelasi timp procentul de celule B naive si celule B de memorie este scazut. Ca urmare a terapiei imunosupresoare conventionale, celulele B naive CD27- si plasmocitele CD27++ sunt marcat reduse, in schimb celulele B de memorie CD27+ nu sunt afectate. Acest lucru sugereaza ca recaderile ar putea avea legatura cu retentia de celule de memorie CD27+. Studiile au aratat ca subseturile de limfocite B circulante nu sunt influentate de varsta sau de sex, dar par a fi influentate de durata bolii (s-a observat cresterea numarului de celule CD27 high si scaderea numarului de celule B naive CD27- de-a lungul timpului)^1;6;9.

Celulele B CD19+/CD5+

Populatia de celule B din periferie poate fi impartita in doua compartimente (B1 si B2) in functie de expresia diferita a moleculelor de suprafata IgD, CD5, CD11b/CD18, CD23 si CD45. Celulele B conventionale  (celulele B2) exprima pe suprafata lor nivele crescute de IgM si IgD, pe cand celulele B1 prezinta o expresie minima pe suprafata lor pentru IgD, CD45 si virtual absenta pentru CD23. In schimb, toate celulele B1 exprima CD5 ARNm, dar nu toate prezinta pe suprafata lor CD5. Din acest motiv, celulele B1 pot fi impartite, in functie de expresia pe suprafata lor a moleculei CD5, in doua subpopulatii: B1a (CD5+) si B1b (CD5-). Se pare ca celulele B1 deriva din progenitori distincti fata de cei ai celulelor B2, ce reprezinta majoritatea celulelor B in timpul vietii fetale. Astfel, toate celulele B din ficatul fetal murin sunt de tip B1 pe cand in splina fetala murina proportia lor este de 40-60%. La animalele adulte celulele B1 reprezinta mai putin de 10% din celulele splenice B IgM+. Celulele B1 se gasesc din abundenta in cavitatea peritoneala.

Studiile au aratat faptul ca la oameni aproximativ 20% din celulele B din sangele periferic sunt CD5+, reprezentand astfel o componenta majora a populatiei de celule B. Celulele B1a produc anticorpi naturali IgM polireactivi, cu specificitate atat fata de antigenele bacteriene cat si fata de autoantigene.

In anumite circumstante acesti anticorpi sunt implicati in patogeneza bolilor autoimune^3;8.

In lupus, celulele T contribuie la alterarea self-tolerantei prin facilitarea productiei de autoanticorpi de catre celulele B autoreactive. Totodata aceste celule prezinta o crestere a expresiei markerilor de activare. In mod normal, la mentinerea tolerantei fata de self contribuie in parte si actiunea supresiva a celulelor T reglatorii (Treg). Studiile au demonstrat ca la pacientii cu lupus in perioada activa exista o scadere a numarului de celule Treg (CD4+/CD25+) in periferie⁴.

Imunofenotipare limfocitara – profil autoimun si recomandari pentru efectuarea acestui test

Profilul autoimun cuprinde urmatoarele celule exprimate in valoare procentuala si absoluta:

• numarul de leucocite, granulocite, limfocite, monocite;
• numarul total de celule T (CD3+);
• celule T helper (CD4+);
• celule Treg (CD25++/CD127-);
• celule T CD8+;
• raport CD4+/CD8+;
• celule  T imature (CD4+/CD8+)
• celule B (CD19+), celule B imature (CD19+/CD5+), celule B CD19+/CD27++;
• celule NK (CD16+/CD56+);
• celule T activate (CD3+/HLA DR+).

Urmarirea tabloului imunofenotipic limfocitar este util in monitorizarea clinica a bolilor autoimune, in corelatie cu tipul si stadiul afectiunii cat si cu tratamentul imunosupresiv administrat⁵.

Specimen recoltat – sange venos⁵. 

Recipient de recoltare – vacutainer ce contine EDTA ca anticoagulant⁵.

Volum proba – 5 mL sange⁵.

Stabilitate proba – sangele trebuie sa ajunga in maxim 24 ore la laboratorul la care se efectueaza testul si in aceasta perioada se pastreaza la temperatura camerei. Este contraindicata refrigerarea probei⁵.

Cauze de respingere a probei – specimene care au depasit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau congelate⁵.

Metoda – citometrie in flux⁵.

Valori de referinta si comunicarea rezultatelor

Buletinul final va contine intervalele de referinta pentru subseturile limfocitare adecvate varstei pacientului  impreuna cu o interpretare a rezultatelor obtinute⁵.

Trebuie cunoscut faptul ca numarul absolut al populatiilor limfocitare este influentat de o serie de factori biologici, inclusiv hormoni, temperatura si mediul inconjurator. Studiile legate de variatiile circadiane au demonstrat o crestere progresiva a numarului de celule CD4+ in cursul zilei, in timp ce limfocitele CD8+ si limfocitele B CD19+ cresc doar in prima parte a zilei, fara a se modifica in cursul dupa-amiezei. Din acest motiv, atunci cand se efectueaza o monitorizare seriata a populatiilor limfocitare se recomanda ca probele de sange sa se recolteze in acelasi moment al zilei⁷.

Citopeniile apar frecvent in LES, severitatea lor fiind influentata de varsta si de etnie. Leucopenia cu neutropenie si limfopenie apare in 15–50 % din cazuri, neutropenia si limfopenia reflectand activitatea bolii si predispozitia la infectii. Limfopenia are o incidenta de 19–62% si consta in reducerea numarului de celule T CD4 circulante si scaderea raportului CD4/CD8⁴.

Bibliografie

1. Annet M.Jacobi et al. Correlation between circulating CD27high plasma cells and disease activity in pacients with systemic lupus erythematosus. In Arthritis &Rheumatism, vol 48, no 5, 2003, 1332 – 1352.
2. Antony Rosen. Mechanism of autoimmunity. In Clinical Immunology. Principles and Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 739 -749
3. Claudia Berek, Andreas Radbruch, Harry W. Schroeder Jr. B-cell development and differentiation. In Clinical Immunology. Principles and Practice , Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 121.
4. Cyntia Aranow, Betty Diamond, Meggan Mackay. Systemic lupus erythematous. In Clinical Immunology. Principles and Practice. Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 749 -765.
5. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog
6. Marcus Odendahl et al. Disturbed peripheral B lymphocyte homeostasis in systemic lupus erythematosus . In The Journal of Immunology, 2000, 165: 5970 – 5979.
7. Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. T- and B-Cell Quantitation by Flow Cytometry. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
8. Paolo Casali. Abner L Notkins . CD5+ B lymphocytes, polyreactive antibodies and human B – cell repertoire. In Trends in Immunology, vol 10, 1989, 364 – 368.
9. T.Dorner, P.E. Lipsky. Correlation of circulating CD27high plasma cells and disease activity in systemic lupus erythematous. In Lupus, vol 13,no 5, 2004, 283 – 289.