Anticorpi ENA-Blot SS-A, SS-B, RNP, Scl-70, Jo-1, Sm

Laborator Synevo

Informaţii generale

Bolile autoimune sistemice se caracterizează prin prezenţa în titruri crescute a autoanticorpilor faţă de proteine intracelulare şi acizi nucleici. Aceşti autoanticorpi sunt denumiţi generic anticorpi antinucleari (ANA) datorită faptului sunt îndreptaţi predominant împotriva antigenelor nucleare, dar ei includ şi anticorpi anticitoplasmatici.

Detectarea ANA are o mare sensibilitate, de aceea este considerat cel mai bun test de screening pentru bolile reumatice sistemice. Prevalenţa ANA în aceste afecţiuni se situează între 20 şi 100%. Pentru identificarea bolilor reumatismale este  foarte importantă diferenţierea ANA^1;5;6. Astfel, sunt descrise în prezent două categorii principale de anticorpi antinucleari:

1.Autoanticorpi ce au drept ţintă antigenică ADN-ul şi histonele;

2.Autoanticorpi ce au drept ţintă antigene nucleare solubile (extractable nuclear antigens = ENA).

Denumirea ENA provine din faptul că aceste antigene au fost extrase iniţial din nuclei cu soluţie salină. Primii anticorpi ENA identificaţi au fost cei îndreptaţi împotriva antigenului Smith (Sm, 1966); ulterior au fost descrise şi alte subtipuri ENA în care au fost incluse alături de antigenele nucleare şi componente citoplasmatice solubile. Principalele antigene utilizate în mod curent în laboratoarele de imunologie sunt: ribonucleoproteine (RNP), Sm, SS-A /Ro, SS-B/La, Scl-70 şi Jo-1. Deşi cei mai mulţi anticorpi  anti-ENA prezintă asocieri specifice cu anumite boli pot exista uneori suprapuneri semnificative⁷.

Anticorpii anti-U1nRNP şi Sm sunt îndreptaţi împotriva  unor antigene care aparţin grupului de ribonucleoproteine mici (snRNP). Acestea sunt complexe formate din  ARN  cu un conţinut înalt de uridină (U-RNA)  şi diverse proteine având o greutate moleculară de 9-70 kDa. Prin cromatografie au fost puse în evidenţă 5 tipuri de U-RNA: U1, U2, U4, U5 şi U6. Particulele de U-nRNP conţin 6 proteine core sau Sm (B, B’, D, E, F, G), iar U1-RNP conţine în plus proteine  specifice (70K, A, C). Astfel, anticorpii anti – U1 RNP reacţionează cu una sau mai  multe proteine specifice în timp ce anticorpii anti-Sm reacţionează cu una sau mai multe proteine core. Acţiunea snRNP este esenţială pentru eliminarea intronilor din pre-ARN-ul mesager (procesul de splicing), rezultând ARNm care va fi exportat din nucleu  şi implicat in procesul de translaţie  a proteinelor de la nivelul ribozomilor.

Titruri crescute de anticorpi  anti-U1 RNP se  întâlnesc cu o prevalenţă de 95-100%  în boala mixtă de ţesut conjunctiv (sindromul Sharp), constituind unul din criteriile de diagnostic al acestei afecţiuni. Titrul de anticorpi se corelează de asemenea cu gradul de activitate a bolii. Anticorpii anti-U1 RNP mai pot fi întâlniţi şi  la pacienti cu LES (15-40%), scleroză sistemică şi polimiozită^1;3.

Anticorpii anti-Sm  sunt îndreptaţi  asupra antigenului Sm, denumit astfel după primul pacient (Stephanie Smith) la care a fost pus în evidenţă. Antigenul Sm face parte din grupul snRNP implicate în procesul de splicing al ARN-ului mesager. Anticorpii anti-Sm sunt întâlniţi la 5-40% din  pacienţii cu LES având o specificitate înaltă (peste 90%) pentru boala lupică.  Împreună cu anticorpii anti-ADN dublu catenari pot fi consideraţi patognomonici pentru această condiţie clinică şi fac parte din criteriile ACR  de diagnostic al LES⁴.

Anticorpii anti-SS-A (Ro)sunt  îndreptaţi împotriva unui antigen care face parte tot din grupul  ribonucleoproteinelor mici (soluble substance A sau Robert antigen).  Acesta este compus dintr-o moleculă ARN (Y1, Y2, Y3, Y4 sau Y5) şi o proteină de 60 kDa. Complexul poate asocia şi o proteină de 52 kDa (Ro52) ,dar  acest lucru este încă controversat în literatura de specialitate. Diverse studii au arătat că serurile pozitive pentru SS-A conţin întotdeauna anticorpi împotriva proteinei native SS-A  de  60 kDa şi adiţional pot avea  şi anticorpi îndreptaţi împotriva proteinei Ro52. Diferenţierea de anticorpii anti-Ro52 are importanţă diagnostică, deoarece aceştia  sunt nespecifici, putând fi detectaţi într-o multitudine de afecţiuni.

Anticorpii anti-SS-A sunt asociaţi cu diverse boli autoimune: Sindrom Sjögren (40-95% din  cazuri), LES (20-60%), ciroză biliară primitivă (20%). Trebuie menţionat că aceşti autoanticorpi apar în 100% din cazurile de lupus  neonatal. Pot fi întâlniţi de asemenea în hepatitele autoimune sau virale.

Anticorpii anti-SS-B (La)  sunt îndreptaţi împotriva unei proteine ce deţine un rol în transcripţia  ARN polimerazei III (soluble substance B sau Lane antigen). La reprezintă probabil un factor de finalizare a transcripţiei care se leagă de capătul 3′ al produşilor de transcripţie nou-generaţi ai ARN polimerazei III. Anticorpii anti-SS-B apar de obicei împreună cu anti-SS-A, fiind asociaţi cu aceleaşi condiţii clinice^1;6;7.

Anti-Ro52 sunt îndreptaţi împotriva unui antigen de 52 kDa şi au fost descrişi ca autoanticorpi nespecifici asociaţi atât cu boli reumatice cât şi non-reumatice. Sunt prezenţi într-un procent de 100% la mamele feţilor sau nou-născuţilor cu bloc atrio-ventricular congenital sau lupus neonatal¹.

Anticorpii anti-Scl-70 sunt îndreptaţi împotriva unei proteine non-histonice de 70 kDa, izolată iniţial din nuclei de celule hepatice provenite de la şobolan. Ulterior, s-a demonstrat că această proteină este un produs de degradare al ADN topoizomerazei I, o clasă de enzime localizate în nucleoplasmă şi nucleoli, având funcţia de a menţine integritatea informaţională a ADN (prin  capacitatea de a scinda şi de a reuni la loc unul din cele două lanţuri ADN).

Anticorpii anti-Scl-70 se găsesc la 40% din pacienţii cu scleroză sistemică forma difuză şi la 10% din pacienţii cu scleroză sistemică forma limitată, fiind un element de prognostic nefavorabil.

Anticorpii anti-Jo-1 sunt îndreptaţi împotriva enzimei histidil-t-ARN sintetaza. In vitro aceşti autoanticorpi se leagă de epitopii conformaţionali ai enzimei şi îi inhibă activitatea catalitică. Antigenul este sub formă dimerică şi este localizat  în citoplasmă; masa moleculară a subunităţilor este 50 kDa. Anticorpii anti-Jo-1 constituie un marker serologic pentru dermatomiozită/polimiozită, având o prevalenţă de 20-40%. Prezenţa acestor autoanticorpi se asociază cu o formă mai severă de boală, cu un prognostic rezervat şi recăderi mai frecvente. Autoanticorpii pot fi detectaţi precoce, uneori precedând debutul simptomelor. La copii anticorpii anti-Jo-1 sunt extrem de rari^1;3;6;7.

Recomandări pentru determinarea anticorpilor ENA BLOT –  evaluarea pacienţilor cu  testul ANA  IIF (imunofluorescenţă indirectă) pozitiv şi cu semne clinice sugestive de  afecţiune  reumatismală sistemică. În general nu se recomandă efectuarea ENA în prezenţa unui rezultat ANA IIF negativ decât dacă pacientul are semne clinice evidente de boală reumatismală şi în special de sindrom Sjögren sau polimiozită (testul ANA poate fi uneori negativ în prezenţa unor anticorpi faţă de antigene foarte solubile, cum ar fi SS-A/Ro sau faţă de antigene citoplasmatice exprimate insuficient pe preparatele Hep-2 sau alte ţesuturi, cum ar fi Jo-1)⁵.

Pregătire pacient – à jeun (pe nemâncate) sau postprandial (după mese)².

Specimen recoltat – sânge venos².

Recipient de recoltare – vacutainer fără anticoagulant cu/fără gel separator².

Prelucrare necesară după recoltare – se separă serul prin centrifugare².

Volum probă – minim 0.5 mL ser².

Cauze de respingere a probei – ser intens hemolizat, lipemic sau puternic contaminat bacterian².

Stabilitate probă – serul separat este stabil 14 zile la 4°C; timp mai îndelungat la -20 °C².

Metodă – imunoblot. Testul utilizează 7 antigene native si recombinate purificate, care sunt fixate  in cip-uri paralele pe membrana unui strip. Antigenele sunt reprezentate, în ordinea fixării pe strip, de:

–          nRNP/Sm: antigen nativ purificat

–          Sm: antigen nativ purificat

–          SS-A: antigen nativ purificat

–          Ro 52: antigen recombinat

–          SS-B: : antigen nativ purificat

–          Scl-70: antigen nativ purificat

–          Jo-1: antigen nativ purificat

Într-o primă etapă strip-ul încărcat cu antigenele purificate este incubat împreună cu serul diluat al pacientului. Dacă în ser sunt prezenţi anticorpi specifici aceştia se vor lega de antigenele corespunzătoare de pe strip. După o etapă de spălare, strip-ul este incubat cu un conjugat anti-IgG uman marcat cu fosfataza alcalină. Conjugatul se va ataşa la porţiunea IgG a complexului antigen-anticorp. După îndepărtarea prin spălare a conjugatului nelegat se adaugă soluţia de colorare (substratul enzimei) – un sistem de detecţie enzimatică colorimetrică . Dacă este prezent conjugatul legat reacţia enzimatică va genera un produs colorat albastru-închis la nivelul benzilor ocupate de anticorpi specifici. Astfel, benzile vizualizate la nivelul stripului sunt rezultatul legării  anticorpilor specifici de antigenele individuale de la nivelul strip-ului.

Pe fiecare strip  există o bandă de control intern. Apariţia unei reacţii de culoare intense la acest nivel certifică faptul că toate etapele testului imunoblot au fost executate corect.

Valori de referinţă  şi interpretarea rezultatelor

Interpretarea definitivă a rezultatelor testului se face cu ajutorul unui software (după scanarea strip-urilor) care în funcţie de intensitatea semnalului, acordă un punctaj pentru fiecare bandă a strip-ului, astfel: 

EVALUARE SEMNAL	INTENSITATE  SEMNAL	REZULTAT
Fără  bandă	0-5	0	NEGATIV
Bandă slabă	6-10	(+)	ECHIVOC
Bandă medie-intensă	11-25 sau 26-50	+,++	POZITIV
Bandă foarte intensă	>50	+++	INTENS POZITIV

În final este calculată suma  punctelor acordate şi se va genera rezultatul testului.

Un rezultat pozitiv confirmă prezenţa anticorpilor specifici .

Un rezultat echivoc indică faptul că prezenţa auto- anticorpilor  este incertă; în funcţie de contextul clinic al pacientului testul va fi repetat la un interval de 1-2 luni.

Un rezultat negativ indică absenţa auto-anticorpilor specifici².

Valori de referinţă²

–          nRNP/Sm: negativ

–          Sm: negativ

–          SS-A: negativ

–          Ro 52: negativ

–          SS-B: negativ

–          Scl-70:negativ

–          Jo-1:negativ. 

Bibliografie 

1. Carlos Alberto von Mühlen, Robert M. Nakamura. Clinical and laboratory Evaluation of Systemic Rheumatic Diseases. In Henry´s Clinical Diagnosis and Management By  Laboratory Methods, Ed.Saunders, 2007, 924-928.
2. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2012. Ref Type: Catalog.
3. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Antinuclear Antibodies. www.labcorp.com  2012. Ref Type: Internet Communication.
4. Soto ME, et al. Gender impact in systemic lupus erythematosus. In Clin Exp Rheumatol22 (2004), 713-721.
5. Tozzoli et al. Guidelines for the Laboratory Use of Autoantibody Tests in the Diagnosis and Monitoring of Autoimmune Rheumatic Diiseases. InAm Clin J Pathol2002, 117, 316-324.
6. van Venrooji WJ et al. The consensus workshop for the detection of autoantibodies to intracellular antigens in rheumatic diseases. In J Immunol Methods5 (1991), 181-189.
7. Yashwant Kumar et al. Antinuclear antibodies and their detection methods in diagnosis of connective tissue diseases: a journey revisited. InDiagnostic Pathology, 2009, 4:1.