Anticorpi antinucleari imunofluorescenta

Informatii generale si recomandari pentru efectuarea testului

Identificarea anticorpilor antinucleari (ANA) reprezinta o parte importanta a imunologiei clinice.

Anticorpii antinucleari sunt anticorpi indreptati impotriva antigenelor nucleare si au fost descrisi intr-o multitudine de afectiuni autoimune sistemice si organ-specifice.

Testul ANA isi are originea in fenomenul L.E care a fost evidentiat pentru prima oara in 1948 de catre Haargraves, Richmond si Morton. Totusi, determinarea celulelor lupice s-a dovedit a fi un test putin sensibil si dificil de standardizat.

In 1950, Coons si Kaplan au utilizat anticorpi specifici marcati cu fluoresceina pentru identificarea antigenelor tisulare. In 1957, Holborow, Weir si Johnson au folosit pentru prima data tehnica imunofluorescentei pentru a demonstra ca serul pacientilor LE pozitivi contine anticorpi care produc o fluorescenta nucleara omogena pe tesuturile umane. In 1961, Beck a descris  si alte tipuri de fluorescenta nucleara in serul pacientilor cu diferite afectiuni reumatice utilizand sectiuni de ficat de sobolan.

Substratul ANA traditional a fost reprezentat mult timp de sectiuni de ficat, rinichi sau stomac de sobolan. Inlocuirea acestui substrat a fost realizata cu mult succes de linia celulara Hep-2 (human epithelial type 2 cells) izolata initial de la un carcinom laringian uman, aceasta permitand recunoasterea a peste 30 pattern-uri nucleare si citoplasmatice determinate de peste 100 autoanticorpi diferiti. Avantajele utilizarii celulelor Hep-2 fata de substratul animal sunt:

• sensibilitate mai mare care permite identificarea mai multor pattern-uri;
• originea umana asigura o mai buna specificitate decat cea animala;
• nucleii celulelor sunt mai mari, iar detaliile nucleare pot fi evidentiate mai bine;
• dispunerea celulelor in monostrat faciliteaza o vizualizare buna a nucleilor;
• distributia antigenului este uniforma;
• rata diviziunii celulare este crescuta astfel incat antigenele exprimate predominant in timpul mitozei  sunt usor de localizat (de exemplu, pattern-ul de tip centromer).

Astfel, substratul Hep-2 permite recunoasterea autoanticorpilor indreptati impotriva antigenelor din toate etapele  mitozei (profaza, metafaza, anafaza, telofaza), ceea ce nu este posibil utilizand substratul animal¹.

Cele mai importante aspecte nucleare descrise la examenul prin  imunofluorescenta indirecta sunt:

• ASPECT NUCLEAR OMOGEN: fluorescenta omogena difuza a intregului nucleu in interfaza celulara; intensitatea fluorescentei este mai pronuntata in regiunea cromozomiala la celulele in mitoza; citoplasma este negativa. Apare asociat in principal cu lupusul eritematos sistemic (LES) comun si lupusul indus medicamentos, dar mai poate sa apara in artrita reumatoida, artrita cronica juvenila si scleroza sistemica (alaturi de aspectul fin patat). Antigenele implicate sunt: ADN dublu catenar (dsDNA), histone, Ku.
• ASPECTUL NUCLEAR OMOGEN INELAR: similar cu cel nuclear omogen, dar cu cresterea intensitatii fluorescentei marginale nucleare in interfaza celulara; citoplasma este negativa. Este un aspect intalnit comun in LES, mai ales in forma activa. Antigenul este reprezentat de dsDNA.
• ASPECT MATRICE NUCLEARA: fluorescenta patata ce da nastere unei retele nucleare spongioase in interfaza celulara. Acest aspect se poate intalni in LES, boala mixta de tesut conjuctiv sau in boli cronice reumatice. Antigenele implicate sunt proteine ribonucleare heterogene (hnRNP).
• ASPECT PATAT FIN: fluorescenta nucleara patata cu aspect fin si distributie uniforma in interfaza celulara. Apare in LES, sindromul Sjögren, sclerodermie, miozita si boala mixta de tesut conjunctiv. Antigenele sunt reprezentate de  SS-A, SS-B, Ku, Ki si Mi-2.
• ASPECT PATAT GROSIER: fluorescenta nucleara patata cu aspect grosier in interfaza celulara. Apare in LES, boala mixta de tesut conjunctiv, sindroame overlap, sindrom Raynaud si psoriazis. Sunt implicate urmatoarele antigene: U1-snRNP sau Sm (proteine ribonucleare mici).
• ASPECT DE TIP CENTROMER: fluorescenta nucleara patata cu aspect fin in interfaza celulara; in cursul mitozei fluorescenta este prezenta la nivelul cromozomilor. Apare in principal in sindromul CREST.
• ASPECT NUCLEOLAR OMOGEN: fluorescenta omogena a nucleolilor. Apare in sclerodermie, miozita,  sindrom overlap miozita-sclerodermie. Antigenul este constituit din complexul PM-Scl cu rol in biosinteza ribozomilor.
• ASPECT NUCLEOLAR PATAT: fluorescenta patata a nuclelolilor; in cursul mitozei fluorescenta este prezenta la nivelul cromozomilor, cu doua aspecte posibile: omogen (antigenul este reprezentat de Scl-70 – ADN topoizomeraza I) si punctat (antigenele implicate sunt ARN polimeraza I si NOR-90); este asociat cu sclerodermia.
• ASPECT NUCLEOLAR ”IN GRAMEZI” (”CLUMPY”):  fluorescenta nucleolara in blocuri. Este intalnit in sclerodermie; antigenul implicat este fibrilarina – o proteina alcalina asociata cu ribonucleoproteina nucleolara U3-snRNPs.
• ASPECT DE PUNCTE NUCLEARE: fluorescenta punctiforma (aproximativ 10 puncte/nucleu) care apare in nucleoplasma separat de nucleoli. Se asociaza clinic cu: ciroza biliara primitiva, sindromul Sjögren, ocazional LES. Antigenele implicate includ complexe de multiproteine (Sp-100), cu rol insuficient cunoscut.
• ASPECT CENTRIOL/CENTROZOM: fluorescenta sub forma de spoturi fine la cei 2 poli ce corespund fusului mitotic. Apare in sindromul Raynaud, mai rar in sclerodermie, sindromul Sjögren sau sindromul CREST. Antigenul este reprezentat de centrozom = sistem de microtubuli ce are rol in formarea fusului mitotic.
• ASPECT MEMBRANA NUCLEARA: fluorescenta fina inelara a membranei nucleare cu scaderea intensitatii fluorescentei in nucleoplasma. Apare in hepatita cronica asociata sau nu cu vasculita, trombocitopenie si LES. Antigenele implicate sunt polipeptide care furnizeaza situsuri de ancorare pentru cromozomi in interfaza celulara: laminine  A, B1, B2, C.
• ASPECT PCNA (PROLIFERATING CELL NUCLEAR ANTIGEN): fluorescenta patata variabila (prezenta doar in unele celule) in interfaza celulara. Apare la 3-6% dintre pacientii cu LES. Ca antigen este implicata ciclina, cu rol in replicarea si repararea ADN-ului.

In figurile de mai jos sunt ilustrate cateva din pattern-urile nucleare descrise:

––

In concluzie, pattern-ul fluorescentei nucleare reflecta specificitatea pentru diferite afectiuni. Astfel, imunofluorescenta indirecta permite diagnosticul primar in cazuri clinice incerte, monitorizarea tratamentului (prin titrul ANA) si poate furniza informatii decisive pentru investigatiile ulterioare^1;2;5.

Pregatire pacient – à jeun (pe nemancate) sau postprandial (dupa mese)³.

Specimen recoltat – sange venos³. 

Recipient de recoltare – vacutainer fara anticoagulant cu/fara gel separator³.

Prelucrare necesara dupa recoltare – se separa serul prin centrifugare³.

Volum proba – minim 0.5 mL ser³.

Cauze de respingere a probei – ser intens hemolizat, lipemic sau puternic contaminat bacterian³.

Stabilitate proba – serul separat este stabil 7 zile  la 4°C; timp mai indelungat la -20 °C³.

Metoda – imunofluorescenta indirecta³.

Valori de referinta si interpretarea rezultatelor

<1/100: Negativ³.

Rezultatele se exprima sub forma unui titru (dilutia pana la care poate fi detectata fluorescenta).

In cazul unui rezultat pozitiv alaturi de titru este mentionat si aspectul obtinut in imunofluorescenta.

Aproximativ 98% dintre pacientii cu LES activ vor prezenta un rezultat pozitiv la screening-ul ANA prin imunofluorescenta. Cu toate acestea a fost identificat un grup de pacienti cu boala lupica “ANA negativi”. Aspectele nuclear omogen si/sau nuclear omogen inelar se coreleaza cu LES, activitatea bolii si cu nefrita lupica.

Aspectul de tip centromer se coreleaza in mod tipic cu sindromul CREST (confirmare prin determinare cantitativa imunoenzimatica).

Aspectele de tip nuclear patat se asociaza cu prezenta anticorpilor fata de antigenele nucleare extractibile (ENA): U1-RNP, Sm, SS-A, SS-B, Scl-70 si Jo-14.

In unele cazuri, pe substratul Hep-2 se pot obtine diverse pattern-uri de fluorescenta citoplasmatica:

-patat fin, cu pete fluorescente dispersate, de dimensiuni mici, in majoritatea cazurilor pe un fond omogen sau patat fin dens; antigenele sunt reprezentate de aminoacil-t-ARN-sintetaze, in special Jo-1; se asociaza cu polimiozita/dermatomiozita;

-patat fin dens, cu fluorescenta granulara difuza, aproape omogena, in intreaga citoplasma; antigenele includ rRNP – fosfoproteine ribozomale; este intalnit la pacientii cu LES care prezinta manifestari SNC;

-polar, cu fluorescenta perinucleara grosiera, cu granule dispuse in gramezi la un pol al celulei ce corespund lamelelor aparatului Golgi; se intalneste rareori in LES, in sindromul Sjögren, boala mixta de tesut conjunctiv, granulomatoza Wegener, infectii virale (EBV, HIV);

-reticular grosier, cu fluorescenta difuza reticulara si granulara grosiera ce cuprinde aproape intreaga citoplasma; antigenele sunt proteine din membrana interna a mitocondriilor (in special M2); se asociaza cu ciroza biliara primitiva;

-reticular fin, cu fluorescenta difuza reticulara si granulara fina corespunzatoare reticulului endoplasmatic; se asociaza cu afectiuni hepatice cronice;

-fibrilar, cu o fluorescenta lineara a fibrelor de stres din citoschelet; antigenele implicate sunt reprezentate de actina si miozina; se intalneste in hepatita autoimuna, ciroza biliara primitiva, boala mixta de tesut conjunctiv;

-segmentar, cu fluorescenta unor segmente mici de fibre; antigenele sunt α-actinina, vinculina, tropomiozina; se asociaza cu miastenia gravis, boala Crohn, colita ulceroasa.

In figurile de mai jos sunt ilustrate cateva din pattern-urile citoplasmatice descrise:

––

In toate aceste cazuri este necesara confirmarea rezultatului pe substraturi specifice sau determinarea prin metode imunoenzimatice².

Limite si interferente 

Persoanele peste 80 ani prezinta o incidenta crescuta (50%) de ANA in titruri joase⁴. 

Bibliografie

1. A.R. Bradwell, R.G. Hushes ,E.L. Harden. Atlas of Hep-2 patterns, Second Edition, 2003.
2. Carlos Alberto von Mühlen, Robert M. Nakamura. Clinical and laboratory Evaluation of Systemic Rheumatic Diseases. In Henry´s Clinical Diagnosis and Management By Laboratory Methods, Ed.Saunders, 2007, 924-928.

3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog
4. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Antinuclear Antibodies. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication
5. Rudolf Mierau, Ekkehard Genth. Autoantibodies in Systemic Rheumatic Diseases. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. Lothar Thomas. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany,1 ed. 1998, 807-833.