Imunofenotipare limfocitara-imunitate tumorala

Laborator Synevo

 

Informatii generale

Transformarea neoplazica a unei celule reprezinta prima etapa din istoria naturala a cancerului. Celula tumorala odata aparuta determina, prin diviziuni successive, formarea unei clone celulare si in final constituirea tesutului tumoral, cu exprimarea principalelor caracteristici ale fenotipului malign si anume : proliferarea excesiva si infinita, migrarea anormala si instabilitatea genetica¹.

La adult leziunea canceroasa reprezinta, in cele mai multe cazuri, stadiul final al unei inflamatii cronice (de exemplu, fumatul se asociaza cu neoplasmul pulmonar, radiatiile solare cu cancerul cutanat), pe cand la copil este rezultatul unei instabilitati genomice progresive, innascuta sau datorata unor leziuni genetice dobandite. Tumorile pediatrice sunt sarace in celule ale imunitatii dobandite (celule T si celule dendritice mieloide)⁶.

Problema existentei cu adevarat a imunovigilentei in cazul tumorilor nu este inca rezolvata. In timp ce in cazul bacteriilor si a virusurilor, care exprima o varietate de proteine straine, sistemul imun poate recunoaste si controla efectiv infectia, in cazul celulelor tumorale, care difera foarte putin de cele normale, raspunsul imun nu mai are aceeasi eficienta².

Antigenele tumorale

In mod ideal, pentru a fi recunoscute ca straine de catre sistemul imun, ar trebui ca antigenele tumorale sa fie exprimate doar de celulele tumorale, nu si de cele normale. In realitate majoritatea antigenelor tumorale sunt putin imunogene, fiind slab exprimate si foarte heterogene. In acelasi timp exista si antigene supraexprimate la nivelul celulei tumorale dar care se gasesc de asemenea in cantitati mici in celulele normale².

Antigenele tumorale recunoscute de limfocitele efectoare au fost clasificate astfel:

 – antigene straine organismului (specific tumorale): molecule ce sunt expresia unor gene mutante, oncogene virale, molecule ce prezinta modificari post-translationale anormale (de exemplu, MUC1- underglycosylated mucin). In cazul acestor proteine mutante doar cateva peptide pot fi potential recunoscute ca straine organismului.

– self-antigene: antigene testiculare, antigene de diferentiere care se exprima doar in anumite tipuri de tesuturi (de exemplu, antigenele de diferentiere exprimate de melanocite si celule melanomatoase implicate in producerea de melanina), antigene supraexprimate de celulele tumorale comparativ cu statusul lor normal (de exemplu, – tirozinaza exprimata in mod normal de toate melanocitele apare in concentratii crescute in celulele melanomatoase); celulele T cu specificitate pentru tirozinaza, ce recunosc si distrug celulele tumorale, pot fi gasite in sangele unor pacienti cu melanom; aceste celule T sunt responsabile de depigmentarea pielii (vitiligo) la acesti pacienti, fapt ce se asociaza cu un prognostic bun; –antigenele fetale (AFP si CEA) prezente in tumori ale ficatului, gonadelor si in diverse adenocarcinoame se gasesc in cantitati crescute in timpul dezvoltarii fetale dar sunt putin exprimate in mod normal la adult; aceste oncogene fetale sunt folosite ca markeri de progresie tumorala; – HER-2/neu , cunoscut ca si c-Erb-2 (receptor tirozin-kinazic omolog cu receptorul factorului de crestere epidermal). Raspunsul fata de toate aceste antigene consta in celule efectoare CD4+ si/sau CD8+^1;2.

Mecanisme de evaziune a apararii imune in cancer

Formatiunile tumorale au proprietatea de a fi tolerate de sistemul imun prin exprimarea unor factori care influenteaza negativ raspunsul imun al organismului.

Exista o serie de motive pentru absenta unui raspuns imun eficace in cazul tumorilor. Fiecare proteina autologa este degradata in citoplasma pana la peptide formate din 9-12 aminoacizi. Aceste peptide sunt transportate de catre un sistem numit  „tranporter associated with antigen processing (TAP)” la reticulul endoplasmic unde sunt legate de moleculele MCH clasa I si prezentate celulelor T CD8+².

In cazul tumorilor, peptidele nu  se “potrivesc” mereu la locul de legare pe moleculele MCH clasa I. Existenta unui mecanism defectuos de procesare a antigenelor la nivelul celulei tumorale (de exemplu, deficitul de TAP) face ca peptidele tumorale sa nu fie transportate la nivelul reticulului endoplasmic si sa nu fie prezentate la suprafata celulei. In multe cazuri diminuarea moleculelor MCH clasa I si II pe suprafata celulelor tumorale impiedica recunoasterea acestora de catre limfocitele T si astfel raspunsul imun nu poate fi declansat^2;6.

Celulele tumorale nu pot fi considerate adevarate celule prezentatoare de antigen, deoarece le lipsesc molecule co-stimulatoare importante, CD80 si CD86, necesare pentru activarea celulelor T. In absenta co-stimularii, prezentarea peptidelor via complex MCH/TCR, duce la anergia celulelor T si toleranta.

Unele celule tumorale sunt de asemenea capabile de a stopa producerea de antigene tumorale  evitand astfel raspunsul imun. De asemenea tumorile pot produce substante imunosupresive asa cum sunt IL-10, TGFβ (transforming growth factor beta), prostaglandine, iar in unele cazuri  celulele tumorale pot exprima molecule MCH I-like ce interactioneaza cu liganzii inhibitori aflati pe celulele T, ducand in final la anergia/apoptoza celulelor T².

Asemanator virusurilor (HIV, HCV), tumorile solide sunt caracterizate prin instabilitate genomica ceea ce conduce la generarea unor neoepitopi identificati potential de moleculele MCH clasa I si II³.

In ultima decada s-a observat un interes crescut fata de  mecanismul dominant de toleranta mediat de celulele T reglatoare – Tregs (CD4+CD25+), ce par sa joace un rol important in autoreactivitate, alergii, infectii si transplant, controland atat raspunsul imun innascut cat si pe cel dobandit, limitand astfel autoimunitatea si imunopatologia. Selectia acestor celule are loc in mod natural in timus – natural T regulatory cells (nTreg), dar pot fi induse si in periferie – induced Treg cells (iTreg). Efectul supresor al celulelor Treg asupra raspunsului imun tumoral este bine documentat. Astfel studiile efectuate pe soareci arata ca indepartarea celulelor Treg favorizeaza rejetul celulelor tumorale putand chiar sa previna dezvoltarea acestora in vivo, atat la soarecii „predispusi la cancer” cat si dupa tratamentul cu agenti chimici. In studiile efectuate pe pacienti cu cancer s-a observat prezenta mult mai frecventa a celulelor Treg in populatia limfocitara periferica decat la persoanele sanatoase. Exista de asemenea rapoarte din care reiese faptul ca nivelele crescute de Treg se coreleaza cu un stadiu avansat al bolii, fiind implicate astfel in progresia cancerului. Infiltrarea cu celule T reglatorii este de asemenea prezenta si in statiile ganglionare metastazate, nu si in cele fara metastaze^1;3.

Mecanisme efectoare ale imunitatii

La adult, raspunsul imun innascut are rolul de a recunoaste celulele “stresate” sau continutul celular nedigerat atunci cand celulele devin nonapoptotice sau nonautofagocitice.

Raspunsul imun adaptativ (dobandit) joaca un rol crucial, fiind o sursa bogata de celule T efectoare CD4 si CD8 cu rol in recunoasterea proteinelor aberante ce apar la nivelul tumorii, in acelasi timp reprezentand sursa unor celule regulatoare si a unor factori cu rol important in limitarea abilitatii celulelor NK si a celulelor T de a media eradicarea cancerului⁶. 

Modul in care diferitele tipuri de celule implicate in generarea raspunsului imun influenteaza in sens pozitiv sau negativ cresterea tumorala este prezentat in tabelul urmator¹:

Celule efectoare	– Inhibarea cresterii tumorale – Favorizarea cresterii tumorale	Actiunea supresiva a celulelor Treg asupra celulelor efectoare	Referinte legate de rolul celulelor Treg
Celule T CD8+	– citotoxice prin perforina/granzima sau ligandul Fas/Fas – secretia de IFNγ,TNFα	supresie prin TGFβ	Piccirillo si Shevach (2001);Somasundaram et al.(2002);Antony et al. (2005) Chen et al. (2005)
Celule T CD4+	– initiaza activarea celulelor CD8+ – citotoxice prin ligandul Fas/Fas – ajuta celulele B – inhiba angiogeneza – activeaza macrofagele prin secretia de IFNγ – recruteaza eozinofilele prin secretia de IL-4	cele mai multe teste functionale de supresie utilizeaza celulele CD4+	Itoh et al. (1999) si multe alte studii ulterioare
Celule γδ	– citotoxice prin NKG2D- activeaza celulele Tαβ pentru a secreta IFNγ	nu a fost analizata
Celule B	– produc anticorpi antitumorali – prezinta antigenele tumorale – initiaza cresterea tumorala cu ajutorul factorului solubil	supresie directa asupra celulelor B fara supresia celulelor Th	Lim et al. (2005)
Celule NK	– citotoxice prin granzime/perforine sau ligandul Fas/Fas- exprima FcR pentru a media ADCC (citotoxicitate celulara dependenta de anticorpi)	– suprima activitatea citotoxica- exista o corelatie inversa intre activarea NK si numarul de celule Treg la pacientii cu neoplasme	Trzonkowski et al. (2004) Romagnani et al. (2005) Ghiringhelli et al. (2005) Smyth et al. (2006) Simon et al. (2007)
Celule NKT	– produc citokine, stimuleaza celulele NK si celulele CD8+- actiune citotoxica– inhiba celulele Th1 si T CD8+ prin lL-3	suprima  secretia de citokine si activitatea citotoxica a celulelor NKT	Azuma et al. (2003) Nishikawa et al. (2003) La Cava et al. (2006)
Celule dendritice	Legatura intre raspunsul imun innascut si cel dobandit– IDO+DC (celule dendritice secretoare de indol amin 2,3- dioxigenaza) inhiba proliferarea celulelor T inducand toleranta	reduce expresia CD80 si CD86 pe celulele dendritice	DiPaolo et al. (2007)
Macrofage	– exprima FcR ce mediaza ADCC sau ADCP(fagocitoza)- tipul M1 este citotoxic prin oxidul nitric– tipul M2 secreta arginaza, favorizeaza angiogeneza, inflamatia si cresterea tumorala	la om, Treg suprima secretia de citokine si mecanismul de prezentare a antigenelor de catre macrofage	Taams  et al. (2005)
Neutrofile	– exprima FcR pentru a media ADCC- citotoxice prin radicali liberi de oxigen, proteaze etc.– secretia de citokine proinflamatorii cum sunt IL1β, TNFα si INF	inhiba radicalii liberi de oxigen si producerea de citokine; induc moartea neutrofilelor	Lewkowicz et al. (2006)
Eozinofile	– actiune tumoricida directa- un numar crescut de eozinofile se asociaza cu un prognostic bun	influenteaza negativ functiile si recrutarea eozinofilelor (posibil prin celulele Th2)	Kearley et al. (2005)

Imunofenotipare limfocitara – profil tumoral si recomandari pentru efectuarea acestui test

In cadrul profilului tumoral sunt determinate atat procentual cat si in valoare absoluta urmatoarele subseturi de limfocite, prin identificarea markerilor de suprafata specifici (moleculele CD):

• limfocitele T totale (CD3+);
• celulele T naive CD45RA+, celulele T de memorie CD45RA- ;
• celule CD31+ (rezerva timica);
• limfocitele T helper (CD3+/CD4+);
• celule Treg (CD25++/CD127-);
• celule T CD8+, celule T CD8+/CD28+ (citotoxice),  celule T CD8+/CD28- (reglatoare);
• raport CD4+/CD8+;
• celule  T imature (CD4+/CD8+);
• celule T activate ( CD3+/HLA DR+);
• celule B (CD19+)
• celule NK (CD16+/CD56+) si NK activate.

Testul este indicat pentru monitorizarea statusului imun la pacienti cu diverse afectiuni maligne, mai ales daca sunt aplicate tratamente de imunostimulare⁴.

In cursul evolutiei neoplaziilor, se instaleaza constant un status de imunodeficienta (ce trebuie urmarit in dinamica) de intensitate diferita in functie de tipul tumorii, stadiul procesului malign si mijloacele de aparare ale organismului⁹.

Celulele T naive CD4+CD31+  reprezinta o subpopulatie a celulelor T CD4+ naive  recent eliberate din timus.

Statusul „CD28” diferentiaza limfocitele CD8 cu proprietati citotoxice. Numarul celulelor T citotoxice nu da informatii despre functia lor, acest lucru fiind posibil prin teste functionale (teste de citotoxicitate)⁴.

Celulele T CD8+ pot fi impartite in functie de expresia pe suprafata lor a receptorului co-stimulator CD28 in CD28+ ( aproximativ 50% din celulele CD8+) si CD28-, fiecare din cele doua populatii limfocitare avand proprietati biologice si secretoare diferite.

Populatia de celule T CD28+ predomina la indivizii sanatosi si prolifereaza in timpul infectiilor virale primare.

S-a observat ca celulele T reglatorii CD8+ CD28-  sunt prezente aproape constant in infiltratul limfocitar tumoral, fiind un potent factor supresor fata de raspunsul imun, putand inhiba, prin intermediul IL 10, atat proliferarea celulelor T cat si citotoxicitatea specifica anti-tumorala^3;8.

Celulele T CD8+ CD28- sunt prezente in procent mai mare in sangele periferic al bolnavilor de cancer decat la voluntarii sanatosi.

Superfamilia CD28 este formata din molecule receptoare cu actiune co-stimulatoare (CD28 si costimulatorul inductibil – ICOS) sau inhibitoare (CTLA-4, PD-1 si BTLA) asupra celulelor T. CD28 si CTLA-4 sunt receptori specifici ai celulelor T pe cand BTLA si PD-1 sunt exprimate si pe celulele B, iar ICOS pe celulele NK.  Activarea sau inhibarea celulelor T ca raspuns la un stimul antigenic necesita doua semnale din partea celulelor prezentatoare de antigen (APC). Primul semnal este reprezentat de antigenul exprimat de APC sub forma peptidelor legate de moleculele MCH, care se leaga de TCR. Recunoasterea antigenului de catre receptorii celulei T asigura specificitatea raspunsului. Al doilea semnal, co-stimulator sau inhibitor, este asigurat de interactiunea unor anumiti receptori ai celulelor T cu liganzii corespunzatori de la suprafata APC. CD28 este considerat prototipul receptorului co-stimulator. Se considera ca CD28 este prezent pe aproape toate celulele T CD4+ si doar pe jumatate din celulele CD8+. In absenta co-stimularii semnalele venite de la TCR pot induce anergia celulelor T. In prezenta celor doua semnale are loc producerea de citokine (de ex. IL2) ca si poliferarea, diferentierea si supravietuirea celulelor T.

De mentionat este faptul ca  atat CD28 cat si CTLA-4 se leaga de aceeasi liganzi (CD80 si CD86) pe suprafata APC. CTLA-4 inhiba productia de IL2 si proliferarea celulelor T, fiind implicat in inductia si mentinerea tolerantei⁷.

Specimen recoltat – sange venos⁴. 

Recipient de recoltare – vacutainer ce contine EDTA ca anticoagulant⁴.

Volum proba – 5 mL sange⁴.

Stabilitate proba – sangele trebuie sa ajunga in maxim 24 ore la laboratorul la care se efectueaza testul si in aceasta perioada se pastreaza la temperatura camerei. Este contraindicata refrigerarea probei⁴.

Cauze de respingere a probei – specimene care au depasit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau congelate⁴.

Metoda – citometrie in flux⁴.

Valori de referinta, comunicarea si interpretarea rezultatelor

Buletinul final va contine intervalele de referinta pentru subseturile limfocitare adecvate varstei pacientului  impreuna cu o interpretare a rezultatelor obtinute⁴.

Trebuie cunoscut faptul ca numarul absolut al populatiilor limfocitare este influentat de o serie de factori biologici, inclusiv hormoni, temperatura si mediul inconjurator. Studiile legate de variatiile circadiane au demonstrat o crestere progresiva a numarului de celule CD4+ in cursul zilei, in timp ce limfocitele CD8+ si limfocitele B CD19+ cresc doar in prima parte a zilei, fara a se modifica in cursul dupa-amiezei. Din acest motiv, atunci cand se efectueaza o monitorizare seriata a populatiilor limfocitare se recomanda ca probele de sange sa se recolteze in acelasi moment al zilei⁵.

Orientativ, prezentam cateva modele patologice de imunofenotipare associate unor afectiuni maligne:

-epiteliom al buzei (operabil): scaderea valorilor procentuale pentru celulele T totale (CD3+), T activate ( CD3+/HLA DR+) si NK ( CD16+/CD56+);

-adenocarcinom de col uterin (stadiul I – II) : scaderea proportiei  de celule T CD8+ (probabil T citolitice) si, inconstant, scaderea celulelor NK (CD16+/CD56+);

-adenocarcinom mamar (stadiul II): limfopenie, scaderea celulelor T totale (CD3+), B totale (CD19+), scaderea raportului CD4+/CD8+,  cresterea celulelor T CD8+ (probabil T supresoare);

-adenocarcinom pulmonar (operabil): limfopenie, scaderea celulelor T totale (CD3+), T activate (CD3+/HLA DR+), inconstant scaderea celulelor B (CD19+)⁹.

Cresterea  celulelor T reglatoare in cursul terapiei imunostimulatoare este nefavorabila, datorita  proprietatilor imunosupresoare ale acestora⁴.

Bibliografie

1. AM Gallimore and AK Simon. Positive and negative influences of regulatory T cells on tumor immunity. In Oncogene (2008) 27, 5886-5893.
2. Gerd-Rudiger Burmester, Antonio Pezzutto. Tumor Immunology. In Color Atlas of Immunology .Thieme 2003, 150-154.
3. Gilberto Filaci et al. CD8+CD28-T regulatory lymphocytes inhibiting T cell proliferative and cytotoxic function infiltrate human cancers. In The Journal of Immunology,2007,179,4323 – 4334
4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog
5. Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. T- and B-Cell Quantitation by Flow Cytometry. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication
6. Michael T Lotze, Markus Y Mapara, Carl H June. Tumor immunology and immunotherapy. In Clinical Immunology. Principles and Practice, , Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 1181-1199
7. Raul M.Torres,John Imboden,Harry W.Schroeder Jr. Antigen receptor genes, gene products, and co-receptors. In Clinical Immunology. Principles and Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 74-75.
8. Simona Fiorentini et al. CD11b expression identifies CD8+CD28+T lzmphocytes with phenotype and function of both naïve/memory and effector cells. The Journal of Immunology,2001,166, 900 – 907
9. Voiculescu C et al. Aplicatiile imunofenotiparii prin citometrie in flux in imunodiagnosticul si monitorizarea unor afectiuni umane. In Citometria de flux in medicina clinica si experimentala, Ed Acad Rom, Buc, 1996, 109-113.