Mutatii K-ras in tumori de colon

Gena KRAS (v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog), omologul celular uman al oncogenei izolate din virusul Kirsten al sarcomului sobolanului, face parte din familia RAS de proto-oncogene care include si doua alte gene: HRAS si NRAS. Toate genele RAS au o structura intron-exon similara, iar proteinele codificate sunt GTP-aze (proteine G care leaga GDP/GTP si actioneaza ca transductori ai semnalului intracelular) cu rol important in procesele de proliferare, diferentiere si apoptoza celulara. Mutatiile genelor RAS sunt frecvent asociate cu diverse tipuri de tumori (20-30% din totalul tumorilor umane); este suficienta o singura mutatie punctiforma  pentru a transforma genele RAS in oncogene potente^1;5.

In 1982 Chang si colaboratorii sai au izolat clonele corespunzatoare genei KRAS din bancile de ADNc placentar si embrionar uman; au fost izolate 2 izoforme denumite KRAS1 si KRAS2. Un an mai tarziu McCoy a caracterizat gena KRAS izolata din linia celulara umana de adenocarcinom de colon (SW480) si a stabilit ca aceasta corespunde izoformei KRAS2 identificata de Chang. Ulterior gena KRAS2 a fost amplificata in cateva linii celulare tumorale. In 1983 McGrath a clonat genele KRAS1 si KRAS2, KRAS1 fiind identificata ca pseudogena. Gena KRAS2 are 6 exoni, este localizata pe bratul scurt al cromozomului 12 si codifica o proteina alcatuita din 188 aminoacizi, cu o masa moleculara de 21.66 kDa; comparatia intre cele 2 gene KRAS a demonstrat ca in cazul KRAS1 lipsesc anumite secvente de interventie, concluzia fiind ca aceasta este o pseudogena copiata dintr-un ARNm procesat  al KRAS2 si incorporata in cromozomul 6. Transcriptul ARNm  KRAS2 major are o lungime de 5.5 kb; in urma splicing-ului alternativ al exonului 5 se formeaza doua izoforme A si B care difera in regiunea C-terminala. In ARNm KRASB exonul 6 codifica regiunea C-terminala; in ARNm KRASA acelasi exon codifica regiunea netranslatata 3’. Regiunile C-terminale diferite ale celor doua izoforme vor suferi modificari post-translationale. Procesarea post-tanslationala diferentiata are efecte functionale marcate ce conduc la cai de semnalizare si localizari alternative ale proteinei⁵.

Proteina K-Ras functioneaza ca un “comutator” ce este deschis si inchis de catre moleculele de GTP si respectiv GDP. In stare activa, legarea GTP induce atasarea de membrana celulara; hidroliza GTP la GDP permite revenirea la forma inactiva, disocierea de membrana si inactivarea transmiterii semnalului la nucleu¹. Proteina K-ras este recrutata de catre receptorul EGFR activ pentru a initia cascada de semnalizare pe calea RAS/MAPK⁴.

EGFR (epidermal growth factor receptor = receptorul pentru factorul de crestere epidermica)  apartine familiei de receptori tirozin kinazici pentru factori de crestere. Reprezinta veriga de legatura intre spatiul extracelular si transductia intracelulara a semnalului; este alcatuit dintr-un receptor extracelular, un domeniu transmembranar lipofilic si un domeniu intracelular cu proprietati de tirozin kinaza. EGFR este activat extracelular de catre liganzi cum ar fi EGF (epidermal growth factor = factor de crestere epidermica) sau TGF-alfa (transforming growth factor – alpha = factorul transformator al cresterii), ce determina homodimerizarea receptorului. Rezulta autofosforilarea receptorului tirozin kinazic care declanseaza diverse cascade de transmitere a semnalului in care proteina K-ras joaca un rol important⁶.

Mutatiile somatice activatoare ale genei KRAS determina schimbarea unui singur aminoacid si conduc la activarea constitutiva a proteinei K-ras, prin impiedicarea hidrolizei GTP (proteina se gaseste permanent in forma activa legata de GTP). Activarea proteinei K-Ras se face in aval de fosforilarea tirozin kinazei EGFR; in continuare transductia semnalului este legata de RAF (root abundant factor), MEK (MAP kinaza, ERK kinaza) si ERK (extracellular regulated MAP-kinaza), ce conduce in final la transcriptia genelor care influenteaza aparitia si progresia tumorilor. Astfel se explica implicarea mutatiilor KRAS in mai multe tipuri de cancer, in special pancreatic, pulmonar si colorectal^2;6.

Cancerul colorectal, ce include tumorile maligne de la nivelul colonului, rectului si apendicelui, este a treia cea mai frecventa forma de cancer si a doua cauza de deces conform WHA (World Health Asssociation). Mutatii KRAS au fost identificate in 40% din carcinoamele colorectale non-ereditare, ce constituie 90% din totalul carcinoamelor colorectale. Studii efectuate pe pacientii proveniti din familii cu cancer colorectal non-polipozic ereditar (HNPCC) au demonstrat ca mutatiile genei KRAS sunt independente de detectarea instabilitatii microsatelite, iar frecventa mutatiilor in cazurile de carcinom ereditar este comparabila cu cea din cazurile sporadice⁶. Mutatiile KRAS constituie in majoritatea cazurilor un eveniment precoce in dezvoltarea si progresia cancerelor colorectale. Cateva studii au demonstrat ca statusul KRAS este un factor important de prognostic.  Astfel, mutatiile KRAS sunt asociate cu tumori in stadiu mai avansat, cu un potential metastatic crescut si cu un prognostic scazut. Pana in prezent au fost comunicate peste 3000 de mutatii punctiforme KRAS in cancerul colorectal (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/). In majoritatea cazurilor anomaliile sunt detectate in codonii 12 (~82% din toate mutatiile KRAS) si 13 (~17%) ai exonului 2; se pare ca aceste mutatii punctiforme missense au un rol important in progresia cancerului de colon². Mutatiile cele mai obisnuite sunt urmatoarele: Gly12Asp, Gly12Ala,Gly12Val, Gly12Ser, Gly12Arg, Gly12Cys si Gly13Asp⁴.

Statusul mutatiilor KRAS are de asemenea impact si asupra deciziilor terapeutice la pacientii cu cancer colorectal. Luand in considerare importanta axei EGFR mentionate mai sus, au fost dezvoltate medicamente care interfera cu domeniile functionale ale receptorului; sunt descrise astfel doua clase de antagonisti EGFR: anticorpi monoclonali anti-EGFR, care se leaga de domeniul extracelular EGFR si intra in competitie cu liganzii naturali blocand activarea receptorului, si molecule mici de inhibitori ai tirozin kinazei EGFR, care intra in competitie cu ATP-pentru legarea domeniului catalitic intracelular al tirozin kinazei (vezi figura 1). La ora actuala au fost aprobate doua preparate de anticorpi monoclonali anti-EGFR in tratmentul cancerului colorectal: Cetuximab (un anticorp monoclonal IgG1 chimeric provenit de la om si soarece) si Panitumumab (un anticorp monoclonal IgG2k uman). A fost dovedit ca ambele preparate reduc riscul de progresie a tumorii si imbunatatesc supravietuirea globala, perioada de supravietuire fara progresie a bolii, precum si calitatea vietii la pacientii cu cancer colorectal refractar la tratament. Cu toate acestea, studiile au aratat ca nu toti pacientii raspund la acesti agenti care au drept tinta moleculara EGFR. Deoarece terapia este costisitoare si este insotita de reactii adverse este esential sa se identifice pacientii care pot beneficia intr-adevar de aceasta^2;4;6.

Literatura de specialitate furnizeaza informatii conform carora mutatii in gena KRAS confera rezistenta fata de anticorpii monoclonali anti-EGFR; mutatiile sunt asociate cu raspuns slab la terapie deoarece acestea activeaza constitutiv calea RAS/MAPK in aval de EGFR, iar terapia anti-EGFR care impiedica legarea ligandului la EGFR nu isi poate exercita efectul inhibitor asupra proliferarii celulare. Concluzionand, statusul genei KRAS este un parametru important in selectarea pacientilor pentru terapie: pacientii cu mutatii nu pot beneficia de terapia anti-EGFR. Pe baza acestor date, Agentia Europeana a Medicamentului (EMEA) a aprobat folosirea cetuximabului si panitumumabului in tratamentul cancerelor metastatice la pacientii care au gena KRAS de tip salbatic (normala)².

Mutatiile KRAS sunt detectate cu ajutorul unor teste moleculare pe probe de tesut tumoral conservat in parafina⁶. In general, un bloc de parafina care contine un material ce provine de la un adenom sau de la un carcinom neinvaziv nu trebuie folosit pentru testarea mutatiilor KRAS. In cazul in care se efectueaza o biopsie pe cale endoscopica din tumora primara sau dintr-o metastaza patologul trebuie sa se asigure ca exista celule tumorale in materialul prelevat si sa indice blocul sau lamele care trebuie utilizate in testul molecular.

––––-

 Fig. 1 Caile de transductie controlate de activarea EGFR si blocarea terapeutica a EGFR; activarea EGFR indusa de ligand duce la activarea a trei cai de transductie importante, RAS-MAPK, PI3K-Akt si STAT, care controleaza transcriptia, progresia, proliferarea celulara, adeziunea, angiogeneza si migrarea celulara. Anticorpii monoclonali anti-EGFR se leaga de domeniul specific extracelular al receptorului, inhiba legarea ligandului si automat  activarea EGFR. Molecule inhibitoare ale EGFR inhiba fosforilarea, activarea cailor de transductie si implicit proliferarea celulara (Adaptare dupa Ensari et al.)

In cadrul testarii mutatiilor KRAS se folosesc in prima etapa tehnici de amplificare PCR; in functie de tesutul analizat, raportul tesut tumoral versus tesut sanatos este variabil si heterogen, rezultand un amestec al tintei de amplificat in care ADN-ul mutant si cel salbatic nu sunt prezente intr-un raport echimolar. De aceea este important ca pentru genotipare tesutul selectat sa contina suficient material tumoral pentru analiza (mai mult de 70% celule de carcinom invaziv). Ulterior are loc secventierea exonului 2 al genei KRAS in vederea detectarii mutatiilor².

Recomandari pentru analiza mutatiilor genei KRAS

Analiza mutatiilor genei KRAS contribuie semnificativ la selectarea pacientilor care pot beneficia de terapia cu anticorpi monoclonali anti–EGFR. Testul genetic se indica la pacientii cu tumori metastatice (stadiul IV)^4;6.

Specimen recoltat – sectiuni nefixate, necolorate din tesut  conservat in parafina (4-5 lame); cu ajutorul unui marker carioca vor fi evidentiate zonele in care este prezent tesutul tumoral³.

Metoda – secventierea exonului 2³.

Raportarea rezultatelor

Va fi comunicata prezenta sau absenta unei mutatii la nivelul codonului 12 sau 13 din exonul 2 al genei KRAS in ADN-ul extras din tesutul tumoral colonic^3;4.

Limite si interferente

Nu toti pacientii care prezinta gena KRAS de tip salbatic raspund la terapia anti-EGFR. Au fost descrise polimorfisme rare care pot conduce la rezultatefals-pozitive sau fals-negative⁴.

Bibliografie

1. Genetics Home Reference. Genes. KRAS. http://ghr.nlm.nih.gov. Reference Type: Internet Communication.
2. Jung A, van Krieken JHJM, Kirchner T, Carneiro F, Seruca R, Bosman FT, Quirke P, Flejou JF, Plato Hnasen T, Hertogh G, Jares P, Langner C, Hoefler G, Ligtenberg M, Tiniakos D, Tejpar S, Bevilaqua G, Ensari A. KRAS mutation testing for predicting response to anti-EGFR therapy for colorectal carcinoma: proposal for an European quality assurance program. In Virchows Arch, 2008, 453: 417-431.
3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.
4. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: KRAS Gene, 7 Mutation Panel, Tumor. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
5. OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man). V-KI-RAS2 KIRSTEN RAT SARCOMA VIRAL ONCOGENE HOMOLOG; KRAS, http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Reference Type: Internet Communication.
6. Stintzing S, Heinemann V, Jung A, Moosmann N, Hiddemann W, Kirchner T, The Treatment of Colorectal Carcinoma With Monoclonal Antibodies – The Importance of KRAS Mutation Analysis and EGFR Status. In Deutsches Arzteblat, 2009; 106(12): 202-6