Determinarea factorului Rh

Laborator Synevo

 

Informatii generale

Antigenele sistemului de grup sanguin Rh sunt codificate de doua gene: RHD si RHCE localizate pe cromozomul 1. RHD codifica antigenul D, in timp ce RHCE codifica antigenele Cc si Ee. Antigenul d nu exista; totusi, prin conventie, d este utilizat pentru a conota absenta antigenului D. RHD si RHCE codifica polipeptide similare, care in membrana eritrocitara formeaza un complex cu glicoproteina asociata Rh. Functia antigenelor Rh nu este cunoscuta, desi pe baza fenotipului celulelor Rh nul este sugerat faptul ca antigenele Rh ar juca un rol structural in membrana eritrocitara. Structura antigenelor Rh sugereaza ca sunt proteine de transport, iar glicoproteina asociata Rh ar putea juca un rol in transportul amoniacului. Exista 45 antigene care au fost atribuite sistemului de grup sanguin Rh, dintre acestea cele mai comune si importante fiind D, C, c, E si e. Desi indivizii pot deveni aloimunizati la antigenele C, c, E si e prin transfuzii si sarcina, acestea sunt mult mai putin imunogenice decat D. Mai putin de 3% din indivizii expusi la antigenele C, c, E, e devin aloimunizati, astfel testarea pretransfuzionala nu se efectueaza de rutina pentru aceste antigene. Dupa antigenele A si B, antigenul D manifesta cea mai inalta imunogenicitate (de 20 ori mai mare decat alte antigene Rh majore); in urma transfuziei de eritrocite D-pozitive aproape 80% din primitorii D-negativi dezvolta anticorpi anti-D. In plus imunizarea anti-D promoveaza in continuare sinteza de anticorpi fata de alte antigene de grup sanguin din sau din afara sistemului Rh⁵. De asemenea antigenul D este implicat in 95% din cazurile de boala hemolitica a nou-nascutului¹.

Un individ este considerat Rh pozitiv daca eritrocitele sale exprima antigenul D, iar termenul Rh negativ se refera la absenta antigenului D. Absenta antigenului D este intalnita al 15-17% din indivizii populatiei albe si este mai putin frecventa in alte populatii. La populatia alba absenta antigenului D se datoreaza deletiei genei RHD, in timp ce la populatia asiatica si neagra se asociaza mai degraba cu inactivarea genei decat cu deletia sa⁵.

Unele eritrocite care exprima antigenul D necesita incubare prelungita cu reactivul anti-D pentru aparitia aglutinarii. Aceste eritrocite sunt considerate antigen D pozitive si sunt descrise ca D slab, anterior denumite D^u (in mai putin de 1% din cazuri). Se considera ca fenotipul D slab apare prin unul din urmatoarele trei mecanisme⁵:

1. a) mostenirea unei gene RHD care codifica o proteina D cu expesie antigenica slabita: este mai comuna la populatia neagra si se asociaza cu haplotipul Dce, iar la populatia alba se asociaza cu haplotipul DCe sau DcE.
2. b) interactiunea genei D cu alte gene: indivizii cu gena D in pozitie trans fata de gena C (ex.: Dce/Ce) prezinta o expresie slabita a genei D.

Indivizii cu fenotip D slab prin unul din aceste doua mecanisme nu formeaza aloanticorpi dupa expunerea la eritrocite D pozitive.

3. c) mostenirea unei gene care codifica un complex antigenic D caruia ii lipsesc unii epitopi, numit si D partial; acesti indivizi pot produce anti-D daca sunt transfuzati cu eritrocite D pozitive. Dintre acestia D^VIprezinta numarul cel mai mic de epitopi si aceste persoane prezinta cel mai mare risc de imunizare, dar semnificativ mai mic decat persoanele D negative³.

Donatorii cu D slab trebuie considerati Rh(D) pozitivi; este important ca acestia sa nu fie gresit etichetati ca Rh negativi, deoarece antigenul D slab poate induce un raspuns imun daca este transfuzat la un individ Rh negativ^1;3;5. Indivizii cu D slab pot fi transfuzati cu sange Rh pozitiv (exceptie D^VI), iar gravidele nu necesita profilaxie cu imunoglobulina anti-D^2;5. Daca se utilizeaza un reactiv monoclonal anti-D adecvat, majoritatea determinantilor antigenici incadrati anterior ca D^u nu trebuie sa mai fie deosebiti de D in conditii de rutina³.

Fenotipul Rh nul apare cand eritrocitele nu exprima antigene Rh, prin cel putin doua mecanisme posibile: mostenirea unei gene care codifica glicoproteina asociata Rh anormale, cu gene RHD si RHCE normale, sau mostenirea unei mutatii a genei RHCE asociata cu D negativ. Fenotipul Rh nul se asociaza cu anomalii structurale eritrocitare cu stomatocitoza si hemoliza. Acesti indivizi formeaza aloanticorpi care interactioneaza cu toate eritrocitele exceptandu-le pe cele Rhnul⁵.

Anticorpii anti-Rh apar prin aloimunizare, in urma transfuziilor incompatibile in sistemul Rh sau in sarcina. Extrem de rar pot aparea anticorpi naturali in sistemul Rh, fara stimuli antigenici cunoscuti (anti-E, anti-C^w), in majoritatea cazurilor irelevanti din punct de vedere clinic^1;3. De asemenea in anemiile hemolitice imune autoanticorpii au adesea activitate anti-Rh¹.

Majoritatea anticorpilor anti-Rh sunt IgG, in special IgG₁ si IgG₃ (aglutinine incomplete), desi unii pot fi IgM, si de obicei nu activeaza complementul⁵. Anticorpii aglutinanti de tip IgM sunt de obicei tranzitorii si apar la inceputul imunizarii¹. Cei mai comuni sunt anticorpii anti-D, care pot provoca boala hemolitica a nou-nascutului si reactii transfuzionale hemolitice severe. Frecventa acestora a scazut semnificativ o data cu profilaxia anti-D la gravidele Rh negativ cu fat Rh pozitiv. Anticorpii anti-C, c, E, e se asociaza cu boala hemolitica a nou-nascutului si reactii hemolitice transfuzionale usoare⁵.

Tiparea Rh a eritrocitelor se face cu seruri anti-D monoclonale care reactioneaza in mediu salin si care contin atat IgM umane (care nu detecteaza categoria D^VI)³, cat si anticorpi policlonali IgG, acestea din urma putand fi utilizate si in testul antiglobulinic pentru D slab². La prepararea serului anti-Rh se adauga albumina umana sau bovina care modifica constanta dielectrica a mediului si favorizeaza aglutinarea eritrocitelor Rh pozitive¹.

Recomandari pentru determinarea factorului Rh

• inaintea unei transfuzii;
• inaintea unei proceduri invazive sau chirurgicale potential asociate cu complicatii hemoragice care ar putea necesita transfuzii;
• monitorizarea imunohematologica antepartum si postnatala a mamei si copilului;
• la donatorii de sange.

In testarea de rutina a grupului sanguin nu se indica determinarea altor antigene Rh in afara factorului Rh D. Determinarea fenotipului Rh complet este indicata la donatorii de sange, trebuie luata in considerare in cazul transfuziilor la fetite si femei premenopauza, la pacienti transfuzati cronic si la primitorii cu anticorpi antieritrocitari iregulari³.

Pregatire pacient  – nu este necesara o pregatire prealabila; sunt utile informatii asupra unor tratamente perfuzabile cu solutii macromoleculare efectuate premergator determinarii, transfuzii in ultimele 120 zile⁴.

Specimen recoltat – a) sange capilar din pulpa degetului; b) sange venos⁴.

Recipient de recoltare – b) vacutainer fara aditivi sau gel activator (capac rosu sau incolor)⁴.

Cantitate recoltata – b) cat permite vacuumul⁴.

Cauze  de respingere a probei – specimen puternic hemolizat⁴.

Stabilitate proba – testul se efectueaza imediat, daca acest lucru nu este posibil, proba se pastreaza 48 ore la 2-8°C⁴.

Prelucrare necesara dupa recoltare – Dupa coagularea completa la temperatura camerei se indeparteaza serul si cheagul. Din hematiile ramase se prepara o suspensie 40% in plasma proprie sau in ser fiziologic. Pentru metoda de aglutinare pe carduri se prepara o suspensie de 5% hematii in mediu special de suspensie^1;4.

Metoda de determinare – hemaglutinare pe placa cu reactiv anti-D IgM monoclonal⁴. Determinarea trebuie efectuata cu doua tipuri diferite de anticorpi monoclonali, iar testarea trebuie sa includa martorul autolog (martor albuminos – se testeaza eritrocitele pacientului cu mediul in care sunt continuti Ac monoclonali), precum si hematii martor de grup O, Rh pozitiv si Rh negativ^1;3.                                      

  – aglutinare si gel-filtrare pe carduri cu microtuburi ce contin un gel impregnat cu reactivul specific antigenului eritrocitar de determinat (anticorpi monoclonali murini sau umani) – test direct de grupaj ABO si de determinare a Ag RH1( D) si a Ag RH 1,2,3 ( DCE)⁴.

La fiecare rulare a probelor se utilizeaza un sange de control de grup si Rh cunoscute⁴.

Interpretarea rezultatelor 

Primitori de sange si nou-nascuti:

• Rh(D) pozitiv daca se obtin rezultate clar pozitive (>=2+) cu ambele seruri test anti-D, iar controlul auto este negativ;
• Rh(D) negativ daca se obtin rezultate clar negative cu ambele seruri test anti-D, indiferent de rezultatul controlului auto.

Este obligatorie testarea suplimentara daca se obtin rezultate slab pozitive (<=2+) sau discordante cu serurile test, iar controlul auto este negativ, precum si daca se obtin rezultate pozitive cu ambele seruri test, iar controlul auto este pozitiv³.

La donatori, daca testul initial pentru D este negativ, trebuie efectuat un al doilea test care detecteaza D slab (acest lucru nu este necesar la primitorii de sange, care trebuie transfuzati cu sange Rh negativ)^1;2. De asemenea determinarea prezentei D slab la femeia gravida elimina tratamentul inutil cu imunoglobulina anti-D. Inaintea etichetarii unui pacient ca D slab trebuie sa ne asiguram ca nu a fost recent transfuzat cu eritrocite Rh pozitive².

Pentru metoda pe carduri

Pentru metoda de aglutinare pe carduri o reactie pozitiva se valideaza numai daca microtubul de control este negativ. Reactia pozitiva se apreciaza in functie de dispersia aglutinatelor în microtub  de la + la ++++, astfel : – rezultat pozitiv ( ++++) ;  – rezultat slab pozitiv ( + pana la +++ ) ;  – rezultat negativ ( – )

Interpretarea rezultatului in microtubul RH1 (D)

Un rezultat pozitiv in microtubul RH1(D) indica prezenta antigenului RH1(D) pe suprafata hematiilor investigate. Cardurile ABO/RH folosite in laborator nu permit detectia tuturor antigenelor D slab imunogene si nici fenotipul RH1 partial categoria VI(D^VI)

Pentru aceste antigene particulare trebuie sa se execute  teste suplimentare.

Interpretarea rezultatului in microtubul RH1,2,3(DCE)

Un rezultat pozitiv in tubul RH1,2,3(DCE) indica prezenta antigenului RH1(D) si/sau RH2(C) si/sau RH3(E) la suprafata hematiilor de testat⁴. 

Limite si interferente

Reactii fals pozitive (martor albuminos pozitiv)¹

• hematii in fisicuri/rulouri (mielom, macroglobulinemie Waldenström) – se reface determinarea dupa spalarea hematiilor;
• poliaglutinarea;
• anemii hemolitice cu autoanticorpi la cald (prezenta de anticorpi IgG pe suprafata hematiilor) – se reface grupajul cu un reactiv din care se elimina albumina, care contine Ac anti-D aglutinanti capabili sa aglutineze hematiile in suspensie salina (anti-D salin).

Reactii fals negative

• anemia hemolitica a nou-nascutului (blocarea situsurilor antigenice D de catre anticorpii materni)¹;
• individ cu Rh D slab – posibila aglutinare slaba si tardiva; aceste cazuri se indruma catre un serviciu de specialitate, unde determinarea D slab se face cu ajutorul testului antiglobulinic indirect cu anti-D IgG (incompleti policlonali)^1;3.

Bibliografie

1. Curs de imuno-hematologie, Institutul de Hematologie, Buc., 1993.
2. Galel, S. Malone III, J. Viele, M. Transfusion Medicine. In Wintrobe’s Clinical Hematology. Lippincott Williams &Wilkins, Philadelphia, 11th Ed., 2003: 832-873
3. Kretschmer, V. Sonneborn, H. Immunohematology. In Lothar Thomas. Clinical Laboratory Diagnostics –Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1 Ed., 1998: 877-934.
4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2013. Ref Type: Catalog.
5. Webert, K. Chan, H. Smith, J. Heddle, N. Kelton, J. Red Cell, Platelet and White Cell Antigens. In Wintrobe’s Clinical Hematology. Lippincott Williams &Wilkins, Philadelphia, 11th Ed., 2003: 792-824.