Chlamydia trachomatis ADN + Neisseria gonorrhoeae ADN – urina (barbati)

Informatii generale

Chlamydia este o bacterie Gram negativa de dimensiuni foarte mici, obligatoriu intracelulara datorita faptului ca nu isi poate sintetiza ATP-ul, fiind cultivabila doar in celulele vii eucariote (oua embrionate sau culturi celulare).

Clasificari recente impart Chlamydiile in 4 familii, dintre care cea mai importanta in patologia umana este familia Chlamydiaceae, care contine doua genuri:

• genul Chlamydia – cel mai important reprezentant fiind C. trachomatis;
• genul Chlamydophila – C. pneumoniae, C. psittaci, C. pecorum, C. abortus, etc.

Chlamydia trachomatis este intalnita aproape in exclusivitate la om. Sunt descrise 15 serovaruri implicate in diverse infectii^1;2.

Infectia cu Chlamydia trachomatis este cea mai frecventa boala cu transmitere sexuala de cauza bacteriana. Grupa de varsta cea mai afectata este 15-25 ani, prevalenta infectiei fiind intre 2 si 25%.

Perioada de incubatie a bolii variaza in general intre 1 si 3 saptamani, ajungand in unele cazuri la 6 saptamani. O mare parte a infectiilor evolueaza asimptomatic: 75% din infectiile la femei si 50% din infectiile la barbati. In cazurile simptomatice la barbat pot aparea uretrita si proctita in faza acuta; in lipsa tratamentului se poate instala cronicizarea cu epididimita, prostatita si artrita reactiva. Simptomele clinice la femeie constau in uretrita, cervicita si bartolinita care se pot complica cu: endometrita, salpingita, pelviperitonita, perihepatita precum si artrita reactiva.

Caracterul asimptomatic al multor infectii cu Chlamydia trachomatis este responsabil de subdiagnosticarea acestora, cu importante consecinte mai ales la femei datorita corelatiei dovedite intre infectia netratata si complicatii cum ar fi sarcina ectopica si infertilitatea.

Fiind o boala cu transmitere sexuala evaluarea partenerilor este obligatorie pentru a preveni reinfectiile.

Ca si in cazul altor boli cu transmitere sexuala infectia cu Chlamydia trachomatis poate facilita transmiterea infectiei HIV. In plus, nou-nascutii se pot infecta la trecerea prin canalul cervical si pot dezvolta conjunctivita, faringita si pneumonie^3;4;5.

Diagnosticul infectiilor cu Chlamydia trachomatis include izolarea agentului patogen in culturi celulare, depistarea antigenului prin metode imunologice si determinarea ADN-ului prin tehnici moleculare. Deoarece culturile celulare sunt laborioase si necesita timp nu se folosesc de rutina fiind apanajul unor laboratoare speciale^3;5

Perioada de incubatie a bolii variaza in general intre 1 si 3 saptamani, ajungand in unele cazuri la 6 saptamani. O mare parte a infectiilor evolueaza asimptomatic: 75% din infectiile la femei si 50% din infectiile la barbati. In cazurile simptomatice la barbat pot aparea uretrita si proctita in faza acuta; in lipsa tratamentului se poate instala cronicizarea cu epididimita, prostatita si artrita reactiva. Simptomele clinice la femeie constau in uretrita, cervicita si bartolinita care se pot complica cu: endometrita, salpingita, pelviperitonita, perihepatita precum si artrita reactiva.

Caracterul asimptomatic al multor infectii cu Chlamydia trachomatis este responsabil de subdiagnosticarea acestora, cu importante consecinte mai ales la femei datorita corelatiei dovedite intre infectia netratata si complicatii cum ar fi sarcina ectopica si infertilitatea.

Fiind o boala cu transmitere sexuala evaluarea partenerilor este obligatorie pentru a preveni reinfectiile.

Ca si in cazul altor boli cu transmitere sexuala infectia cu Chlamydia trachomatis poate facilita transmiterea infectiei HIV. In plus, nou-nascutii se pot infecta la trecerea prin canalul cervical si pot dezvolta conjunctivita, faringita si pneumonie^3;4;5.

Diagnosticul infectiilor cu Chlamydia trachomatis include izolarea agentului patogen in culturi celulare, depistarea antigenului prin metode imunologice si determinarea ADN-ului prin tehnici moleculare. Deoarece culturile celulare sunt laborioase si necesita timp nu se folosesc de rutina fiind apanajul unor laboratoare speciale^3;5

Numeroasele studii au indicat ca tehnicile de amplificare ADN detecteaza cu aproximativ 15% mai multe infectii comparativ cu celelalte metode care nu se bazeaza pe culturi celulare, cu o specificitate >99%. In plus, testul ADN poate utiliza probe care nu sunt compatibile cu metodele bazate pe culturi cum ar fi cele de urina la barbati⁶.

Pe langa ADN-ul cromozomial C. trachomatis contine o plasmida criptica care este comuna tuturor serovarurilor. Din acest motiv, testele moleculare au drept tinta secvente nucleotidice de la nivelul acestei plasmide. In 2006 a fost descrisa pentru prima data varianta suedeza de Chlamydia trachomatis ce prezinta prezinta o deletie de 377 bp in interiorul plasmidei ADN si care nu este detectata de unele teste comerciale⁵.

Neisseria gonorrhoeae, un diplococ Gram negativ, este agentul etiologic al gonoreei, una din cele mai frecvente boli cu transmitere sexuala.

La barbati infectia este in cele mai multe cazuri simptomatica, fiind asociata cu uretrita anterioara insotita de secretie purulenta. Perioada de incubatie este de 1-10 zile. La femei principala localizare a infectiei este endocervixul. Se descrie o prevalenta crescuta a coinfectiilor cu Chlamydia trachomatis si Trichomonas vaginalis precum si asocierea cu vaginoza bacteriana. Multe dintre femei raman asimptomatice si din acest motiv nu se prezinta la medic. Atunci cand apar manifestarile clinice acestea sunt reprezentate de secretii vaginale modificate, disurie, dispareunie, sangerari intermenstruale. Alte posibile localizari ale infectiei gonococice sunt rectul, faringele, conjunctiva; rareori se pot produce infectii diseminate. Copiii nascuti din mame infectate pot prezenta conjunctivita.

In absenta tratamentului antibiotic adecvat se pot dezvolta complicatii acute sau tardive, cum ar fi: epididimita sau prostatita la barbati; boala inflamatorie pelvina, perihepatita, infertilitate, sarcini ectopice la femei^3;4;5.

1. gonorrhoeaeeste un germene labil care nu supravietuieste in probele ce sunt recoltate in afara laboratorului. Din acest motiv, diagnosticul microbiologic bazat pe cultura are valoare scazuta in aceste cazuri.

Dezvoltarea tehnicilor de amplificare a acizilor nucleici a imbunatatit depistarea infectiilor cu gonoc, aceste tehnici prezentand in mod evident o serie de avantaje in comparatie cu metodele clasice de cultivare:

• deoarece este detectat ADN-ul bacterian nu este necesar ca microorganismul sa fie viabil;
• prezinta o sensibilitate mai mare;
• la barbati testul poate fi efectuat din urina, ceea ce creste complianta pacientilor la investigatie⁶.

Ca o concluzie la cele mentionate mai sus Chlamydia trachomatis (CT) si Neisseria gonorrhoeae (GC) sunt agentii patogeni cel mai frecvent implicati in bolilele cu transmitere sexuala de cauza bacteriana. Foarte important,  coinfectia CT-GC este raportata in aproximativ 30% din cazuri (mai frecvent la femei) de unde si necesitatea testarii combinate a celor doi patogeni.

Diagnosticul precoce al infectiilor constituie o provocare deoarece o mare parte din persoanele afectate nu prezinta simptome. In absenta diagnosticului si tratamentului pot conduce la infectii diseminate la barbati si la boala inflamatorie pelvina la femei cu consecinte tardive semnificative: infertilitate, sarcina ectopica, durere pelvina cronica^4;7.

In cazul ambelor infectii este posibila transmiterea perinatala cu dezvoltarea conjunctivitei la nou-nascut. De asemenea, CT si GC se asociaza cu risc crescut de transmitere a infectiei HIV⁷.

Una din cele mai bune metode de a preveni complicatiile infectiilor CT si GC este screening-ul adolescentilor si adultilor tineri precum si a femeilor gravide. Daca o persoana este diagnosticata cu una sau ambele infectii toti partenerii sexuali trebuie testati si tratati corespunzator⁴.

Ghidul CDC (Centers for Disease Control and Prevention) recomanda ca screening-ul sa se efectueze cu teste de amplificare a acizilor nucleici cu sensibilitate si specificitate inalta, confirmand faptul ca metodele moleculare constituie in prezent standardul de diagnostic al infectiilor CT si GC³.

In laboratorul nostru se utilizeaza o metoda real-time PCR complet automatizata a carei performanta a fost recent evaluata in cateva studii. Acestea au indicat faptul ca testul are o sensibilitate si specificitate foarte bune pentru detectia calitativa a ADN-ului CT si NG in probe urogenitale, dovedind in acelasi timp si o eficienta inalta:

-pentru CT: sensibilitate de  97.6-98%, specificitate de ≥99.6%;

-pentru GC: sensibilitate de  96.9-100%, specificitate de ≥99.8%^8;9.

Din punct de vedere tehnic testul are la baza amplificarea a doua secvente ADN tinta pentru fiecare din cei doi agenti patogeni in scopul reducerii numarului de rezultate fals-negative si fals-pozitive. Astfel,  in cazul CT sunt utilizati primeri si sonde specifice pentru o secventa de aproximativ 206 nucleotide din plasmida criptica precum si pentru o secventa de cca 182 nucleotide din cadrul ADN-ului cromozomial (gena ompA care codifica proteina majora a membranei externe). Pentru NG se folosesc primeri si sonde care tintesc atat o secventa de aproximativ 190 nucleotide din regiunea repetitiva directa inalt conservata  denumita DR-9 cat si o secventa de ~ 215 nucleotide identificata drept o varianta de secventa conservata din aceasta regiune. In plus, este introdus in fiecare proba un control intern CT/NG reprezentat de o combinatie de doua plasmide ADN neinfectioase care monitorizeaza toate etapele  reactiei PCR.

In ceea ce priveste performanta analitica, testul este capabil sa identifice alaturi de cele 14 serovaruri si varianta suedeza de CT; in cazul NG nu exista reactii incrucisate cu bacteriile Neisseria cinerea, flava, lactamica, perflava, subflava raportate la alte teste moleculare^5;8.

Ca tip de probe sunt utilizate tamponul endocervical la femei si urina primul jet la barbati. Mentionam ca in cazul barbatilor testarea probelor de urina prezinta o sensibilitate si specificitate foarte bune reprezentand o alternativa non-invaziva la analiza probelor uretrale¹⁰.

Recomandari pentru determinarea Chlamydia trachomatis ADN – diagnosticul infectiilor acute urogenitale, screening-ul infectiei la persoanele cu risc crescut; screening-ul gravidelor in primul trimestru de sarcina(pentru gravidele ≤ 25 ani cat si pentru cele cu risc crescut de infectii CT si NG testarea va fi repetata si in trimestrul III; in cazul gravidelor la care s-a obtinut un rezultat pozitiv in trimestrul I testarea va fi repetata dupa 3-6 luni)^3;6.

Specimen recoltat – se vor recolta probe provenite din tractul urogenital: tampon endocervical pentru femei si urina primul jet pentru barbati; pentru femei se vor utiliza tampoanele incluse in sistemele de recoltare furnizate de laborator (vezi figura 1).

Recoltarea probei endocervicale

Inainte de recoltarea propriu-zisa se va indeparta mucusul in exces de la nivelul orificiul colului cu ajutorul unuia din cele doua tampoane incluse in kit; se va introduce apoi celalalt tampon in canalul cervical, se va roti bland de 5 ori intr-o singura directie dupa care se va retrage usor, se va evita contactul cu mucoasa vaginala si se va introduce in tubul de transport; se va rupe tamponul in dreptul semnului astfel ca numai capatul tamponului va ramane in tubul de transport ce va inchis etans cu capacul. Tubul va fi etichetat corespunzator si trimis la laborator.

  –––

Fig. 1 Sistem de recoltare a probelor endocervicale

Recoltarea probei de urina

Inainte de recoltarea propriu-zisa pacientul nu trebuie sa urineze timp de cel putin 1 ora; apoi se recolteaza intr-un recipient de unica folosinta prevazut cu un capac etans (de exemplu, paharul pentru urina din 24 ore furnizat de laborator)  aproximativ 10-20 mL din primul jet de urina.

In decurs de 24 ore de la recoltare proba de urina trebuie transferata in tubul de transport din fig.2. Pana atunci proba va fi mentinuta la 2-30ºC.

Transferul probei in tubul transport va fi efectuat la sediul laboratorului utilizand pipeta de plastic din kit. In cazul in care probele nu pot ajunge in laborator in decurs de 24 ore colaboratorii Synevo vor solicita tuburi de transport in vederea transferarii probelor in locatiile respective.

Pentru a se asigura un volum corect de urina nivelul lichidului trebuie sa se situeze intre cele doua linii negre marcate cu sageti pe eticheta tubului. Tubul va fi inchis etans si etichetat corespunzator. Pentru o buna omogenizare a urinei cu mediul stabilizator din tub se vor efectua 5 miscari de inversiune a tubului⁵.

–––-

Fig. 2 Sistem de transfer al probelor de urina

Stabilitate proba – 3 luni la temperaturi de 2-30ºC pentru probele endocervicale si pentru probele de urina stabilizate (transferate in tub)⁵.

Metoda – Real-time PCR; sunt folosite urmatoarele tipuri de controale: control intern CT/NG, control negativ si control pozitiv³.

Limite de detectie

CT:   3 IFU/mL pentru probele endocervicale

        1.5 IFU/mL pentru probele de urina

IFU = unitati de formare a incluziilor

NG:  9 UFC/mL pentru probele endocervicale

        4.5 UFC/mL pentru probele de urina

UFC = unitati de formare a coloniilor⁵.

Valori de referinta

Chlamydia trachomatis (CT) ADN nedetectabil.

Neisseria gonorrhoeae (NG) ADN nedetectabil

Un rezultat invalid indica o eroare de amplificare a acizilor nucleici fiind necesara retestarea probei sau in unele cazuri, repetarea recoltarii⁵.

Limite si interferente

Un rezultat nedetectabil nu exclude prezenta unei infectii deoarece rata de detectie depinde de calitatea probei recoltate, numarul de microorganisme prezente in proba, stadiul infectiei precum si de tulpinile CT/NG infectante.

Prezenta mucusului in probele endocervicale poate inhiba reactia PCR. De asemenea prezenta sangelui intr-un procent mai mare de 5% (v/v) in probele endocervicale si mai mare de 0.35% (v/v) in probele de urina transferate poate conduce la rezultate invalide sau fals-negative.

Valoarea predictiva a testului este influentata de prevalenta infectiei intr-o anumita populatie sau grup. Astfel, in grupurile cu prevalenta crescuta a bolilor cu transmitere sexuala valoarea predictiva pozitiva este crescuta. In schimb in grupurile cu prevalenta scazuta a acestor categorii de infectii rezultatele pozitive trebuie sa fie atent interpretate in contextul clinic general al pacientului, luand in considerare si posibilitatea existentei unor rezultate fals pozitive.

Performanta stabilita pentru probele de urina se bazeaza pe testarea primului jet de urina. Pentru alte tipuri de probe de urina performanta nu a fost evaluata.

Testul nu detecteaza variantele de C. trachomatis lipsite de plasmide insa acestea sunt rar intalnite in infectiile genitale.

In general, testul nu se recomanda pentru aprecierea eficientei tratamentului antibiotic deoarece acizii nucleici din acesti patogeni pot persista cel putin 3 saptamani dupa incheierea terapiei. Dupa aceasta perioada de timp retestarea este utila in cazul gravidelor, atunci cand se suspecteaza o lipsa de complianta la tratament sau o reinfectie si in cazurile in care simptomatologia persista.

Testul nu va fi folosit in practica medico-legala (in cazurile de abuz sexual), cultura celulara fiind singura metoda acceptata in aceste situatii⁵. 

Bibliografie

1. Betty A. Forbes, Daniel S. Sahm, Alice S. Weissfeld – Obligate Intracellular and Nonculturabile Bacterial

Agents. Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology, 12th ed., 2007, 510-524.

2. Richard A. McPetersen, Matthew R. Pincus. Chlamydial, Rickettsial, and Mycoplasmal infections. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods- Sauders Elsevier 21-Ed 2007- pg 1002, 1003.
3. Centers for Disease Control and Prevention, “Sexually Transmitted Diseases Treatment Guidelines 2010,” MMWR Recomm Rep, 2010, vol. 59(RR12):1-116.
4. Bernard M. Karnath. Manifestations of Gonorrhea and Chlamydial Infections. In Hospital Physician May/June 2009. www.turner-white.com.
5. Laborator Synevo. Referinte specifice tehnologiei de lucru utilizate 2013. Ref Type: Catalog.
6. Johnson RE, Newhall WJ, Papp JR, et al, “Screening Tests to Detect Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae,” MMWR Recomm Rep, 2002, 51(RR15):1-38.
7. Specialty Laboratories. Chlamydia trachomatis & Neisseria gonorrhoeae for symptomatic and asymptomatic patients. www.specialtylabs.com. Ref Type: Internet Communication.
8. Rebecca Rockett, Namraj Goire et al. Evaluation of the cobas 4800 CT/NG test for detecting Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. In Sex Transm Infect 2010;86:470-473.
9. Barbara Van Der Pol,a,b Oliver Liesenfeld, et al. Performance of the cobas CT/NG Test Compared to the Aptima AC2 and Viper CTQ/GCQ Assays for Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. In Journal of Clinical Microbiology, 2012, vol. 50, No.7, p. 2244-2249.
10. Taylor SN, Liesenfeld O, et al. Evaluation of the Roche Cobas CT/NG test for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in male urine. In Sex Transm Dis. 2012, 39(7): 543-9.