Alergeni–testul de transformare limfoblastica LTT

Istoricul si principiul LTT

LTT este in acest moment singura metoda de laborator de determinare a sensibilizarii celulare specifice (hipersensibilitate de tip IV).

Dezvoltarea testului in 1962 s-a bazat pe observatia ca incubarea limfocitelor cu fitohemaglutinina, un mitogen, conduce la activarea si proliferarea celulara¹. De atunci LTT a cunoscut o imbunatatire semnificativa datorita noilor tehnici de culturi celulare si metode analitice, devenind un test inalt sensibil si reproductibil atat pentru cercetarea medicala cat si pentru diagnosticul de rutina².

Principiul LTT se bazeaza pe faptul ca limfocitele care au fost sensibilizate anterior fata de un anumit antigen prolifereaza si se transforma in blasti atunci cand sunt expuse din nou la acelasi antigen. Exista cateva metode fizice si chimice de cuantificare a procesului de transformare limfoblastica in concordanta cu mecanismele biologice variate care se produc la nivel celular. Acestea includ  masurarea unor procese metabolice cum ar fi biosinteza proteica, sinteza acidului ribonucleic (ARN) sau a acidului dezoxiribonucleic (ADN). Testul care masoara replicarea ADN-ului este cel mai larg folosit, fiind recomandat de Uniunea Internationala a Societatilor Imunologice (IUIS)⁵; mai exact, se determina incorporarea unui deoxiribonucleotid marcat in celulele-fiica ale limfocitelor activate; citirea rezultatelor se efectueaza dupa 8-12 h, interval de timp suficient pentru ca toate celulele sa treaca printr-un ciclu de diviziune cu sinteza ADN-ului in faza S; se considera ca replicarea ADN-ului domina incorporarea. Pentru incorporare este utilizat cel mai frecvent un nucleozid marcat cu izotop radioactiv (timidina marcata cu ³H).

O reactie pozitiva la LTT demonstreaza existenta limfocitelor antigen-specifice (celule cu memorie) in sangele pacientului⁶.

Performanta actuala a LTT

Nu cu mult timp in urma LTT prezenta o sensibilitate mica si nu avea nici macar valoarea testului epicutan (patch test). Specificitatea sa era de asemenea scazuta, ceea ce se reflecta in numeroasele reactii pozitive cu relevanta clinica incerta si dificil de interpretat. In ultimii ani acest lucru s-a schimbat fundamental.Tehnologiile LTT folosite astazi in laboratoarele de imunologie se remarca prin sensibilitate, specificitate si acuratetete diagnostica mare. La aceasta au contribuit dezvoltarea tehnicilor de culturi celulare si de medii, calitatea alergenilor folositi pentru stimulare celulara si nu in ultimul rand metodele de masurare perfectionate.

Astfel, variantele noi de LTT au o sensibilitate si specificitate crescute datorita adaugarii in culturile celulare a interferonului alfa obtinut prin tehnici genetice. In placile de microcultura este posibil sa se efectueze mai multe teste cu fiecare alergen.

Pe de alta parte, aparatele de scintilatie in lichid folosite pentru determinarea activitatii ³H-timidinei au fost inlocuite de cele mai moderne contoare beta in faza solida, care fac inutila manipularea ulterioara a celulelor stimulate alergenic.

In cazul indicatiei corecte, a efectuarii si interpretarii testului intr-un centru specializat, sensibilitatea si specificitatea  LTT ajung la 78- 85%.

In concluzie, LTT-ul actual, datorita tehnicilor moderne, este o metoda de laborator care si-a gasit locul in diagnosticul celor mai diferite tablouri de boala².

Indicatiile LTT

Paleta de indicatii a LTT cuprinde domenii importante ale imunopatologiei:

– sensibilizarea de tip celular (alergie de tip IV) la medicamente, metale, materiale dentare, alimente;

– defecte sau tulburari functionale ale sistemului imun celular;

– reactivitatea limfocitara fata de agenti infectiosi (Borrelia, Chlamydia, Yersinia, virus herpes simplex).

LTT este o analiza de laborator, care pe langa o dotare tehnica moderna si costisitoare necesita multa experienta si calificare din partea personalului de laborator. Din acest motiv este o analiza pe care o pot face doar laboratoare sau institute specializate².

Metoda LTT propriu-zisa

Cuprinde urmatoarele etape:

1.  izolarea limfocitelor din sangele periferic heparinat prin centrifugare in gradient de densitate Ficoll; este obligatoriu ca sangele sa fie transportat la laborator in conditii ambientale iar centrifugarea sa se efectueze in decurs de 24 ore de la recoltarea probei;
2. dupa resuspendarea celulelor in mediul de cultura se vor transfera 1,2×10⁶celule pe o placa de cultura sterila (replicate in triplu);
3. adaugarea alergenelor/antigenelor si mentinerea culturilor celulare la 37˚C in atmosfera de 5% CO₂; sunt necesare anumite concentratii pentru obtinerea unui raport optim intre limfocite si antigen care sa permita proliferarea maxima; in prealabil se efectueaza si teste de citotoxicitate, pentru a se asigura ca acele concentratii de antigen folosite nu exercita un efect toxic asupra limfocitelor, care ar putea altera astfel testul;
4. cresterea specificitatii testului prin adaugarea de α-interferon, ser autolog si glutamina;
5. in ziua 6 se va adauga in culturile de celule, pentru un interval de 12 ore,  timidina marcata cu³H   care se va incorpora in celulele-fiica ale limfocitelor activate; dupa aceea celulele sunt colectate in filtre din fibre de sticla si se trece la etapa de masurare;
6. cuantificarea sintezei noi de ADN induse de antigen prin masurarea intr-un contor beta a ratei  incorporarii³H-timidinei.

Aceste etape sunt ilustrate in figurile de mai jos:

–-

Pentru determinarea functiei limfocitare nespecifice se adauga in culturile celulare si un mitogen, cum ar fi PWM (poke weed mitogen), care stimuleaza policlonal limfocitele B si T (controlul pozitiv al testului). Nu in ultimul rand, participa la etapele testului si mediul de cultura cu limfocitele pacientului fara antigene adaugate, ca un control al proliferarii spontane (controlul negativ al testului).

Rata incorporarii ³H-timidinei in ADN este direct proportionala cu proliferarea limfocitara. Din rata de incorporare a timidinei  (cpm= counts per minute; numarul de ionizari pe minut) este calculat un index de stimulare (SI):

SI = radioactivitatea incorporata in culturile cu antigen/ radioactivitatea incorporata in culturile fara antigen

SI este evaluat pentru fiecare antigen in parte.

Adaugarea α-interferonului si a serului autolog proaspat in placa de cultura creste SI prin intensificarea proliferarii specifice induse de antigen si reducerea proliferarii spontane nespecifice a limfocitelor, mai ales in zilele 4-6. Acest lucru este in special util la pacientii imunodeprimati si in cazurile in care limfocitele T specifice sunt in numar redus. Efectul pozitiv al folosirii α-interferonului a fost confirmat prin studii care au inclus pacienti cu alergie de contact la nichel si aur^2;7.

Interpretarea rezultatelor

1. Rezultat negativ

SI < 2 = nu exista sensibilizare de tip IV fata de preparatele testate.

2. Rezultat pozitiv

SI cuprins intre 2 si 3: rezultat inalt sugestiv pentru o reactie pozitiva;

SI>3: rezultat net pozitiv.

3. Rezultat neconcludent

 Apare in situatia in care nu s-au obtinut criteriile de validare fie a controlului pozitiv (lipsa de activare policlonala a limfocitelor), fie a controlului negativ (proliferare spontana crescuta). In conditiile in care recoltarea si transportul probei s-au efectuat in conditii adecvate, lipsa de validare a testului se poate datora:

       – tratamentului prelungit cu imunosupresoare;

       – proliferarii spontane crescute ca urmare a unei hiperactivitati a sistemului imun².

Limite si interferente 

LTT evidentiaza numai sensibilizarea limfocitelor si predispozitia catre reactiile alergice, fara ca aceasta sa conduca in mod necesar la manifestari clinice.

Intensitatea raspunsului limfocitar este influentata de factori cum ar fi: reactia alergica propriu-zisa, durata sensibilizarii si intervalul de timp de la aparitia simptomelor clinice si pana la efectuarea testului. In mod obisnuit, proliferarea limfocitara se reduce in decurs de 4-8 saptamani de la intreruperea expunerii la alergenele sau antigenele responsabile de manifestarile alergice, ca urmare probabil a migrarii limfocitelor sensibilizate in ganglionii limfatici; totusi in unele cazuri poate fi detectata cativa ani.

Se estimeaza ca intervalul optim de efectuare LTT este de 10 zile pana la 6 saptamani de la episodul alergic; daca se recomanda LTT mai tarziu este posibil sa se obtina rezultate fals negative. De asemenea, se mai pot obtine rezultate fals negative daca limfocitele pacientului nu sunt sensibilizate la preparatul nativ testat ci la diverse haptene sau metaboliti^3;4.  

Bibliografie

1. C. Schütt. Lymphozytentransformationstest. In Immunologische Arbeitsmethoden, H. Friemel (Ed.), pp. 585–594, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart (1988).
2. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.
3. N. Brattig, G. J. Diao, P. A. Berg. The specificity of the lymphocyte transformation test in a patient with hypersensitivity reactions to pyrazolone compounds. A 10-week follow-up study before and after rechallenge In Eur. J. Clin. Pharmacol. 35, 39–45 (1988).
4. P. A. Berg and E. W. Becker. The lymphocyte transformation test – a debated method for the evaluation of drug allergic hepatic injury. In J. Hepatol. 22, 115–118 (1995).
5. Report of the Committee on Clinical Immunology of the IUIS. Eur. J. Immunol. 6, 231–234 (1976).
6. Sieben S, Hertl M, Al Masaoudi T, Merk HF and Blomeke B (2001a) Characterization of T cell responses to fragrances. In Toxicol Appl Pharmacol 172:172-8 (2001).
7. V. von Baehr, W. Mayer, C. Liebenthal, R. Von Baehr, W. Bieger, HD Volk. Improving the in vitro antigen specific T cell proliferation assay: the use of interferon-alpha to elicit antigen-specific stimulation and decrease bystander proliferation. In Journal of immunological method, 251(1-2):63-71, 2001.