Medulograma

Laboratorul Synevo

 

Informatii generale

Diagnosticul si monitorizarea multor boli hematologice depinde de examinarea maduvei osoase, in special in conditiile in care procesul patologic are originea in maduva. De multe ori studiul citologic al maduvei trebuie corelat cu examenul histologic al biopsiei osteo-medulare care aduce informatii suplimentare cantitative si arhitecturale. De asemenea, in  unele cazuri, examenul maduvei osoase este completat cu efectuarea de coloratii specifice necesare pentru evaluarea depozitelor de fier (coloratia Perls/cu albastru de Prusia), diagnosticul diferential al leucemiilor acute (coloratii citochimice pentru mieloperoxidaza, esteraze nespecifice, PAS), diagnosticul lipidozelor (coloratia PAS in boala Gaucher) sau cu studii citogenetice sau moleculare^3;5.                       

Indicatii

• Diagnosticul anemiei megaloblastice;
• Diagnosticul mielomului multiplu;
• Diagnosticul lipidozelor: boala Gaucher, boala Niemann-Pick, sindromul histiocitelor “albastre ca marea”;
• Investigarea unei citopenii fara o cauza aparenta, pentru confirmarea/infirmarea unei leucemii, sindrom mielodisplazic, hipo-/aplazie medulara, agranulocitoza;
• Diagnosticul, clasificarea si monitorizarea leucemiilor acute;
• Diagnosticul si monitorizarea sindroamelor mielodisplazice;
• In leucemia mieloida cronica, pentru examen citogenetic si pentru diagnosticul de faza accelerata sau puseu blastic;
• Rar in investigarea unei anemii microcitare hipocrome, pentru diferentierea anemiei feriprive de anemia din bolile cronice, prin cercetarea depozitelor de fier (hemosiderinei) medulare;
• Diagnosticul bolii Waldenström;
• In anemiile hemolitice pentru diagnosticul crizelor aplastice^2;5.

Pregatire pacient – à jeun/postprandial; anestezie locala pana la periost la locul de punctionare, eventual premedicatie cu tranchilizante la pacientii sensibili¹.

Specimen recoltat – aspiratul medular este obtinut de preferinta prin punctia osului iliac (spina iliaca postero-superioara), care este lipsita de incidente majore si poate fi asociata cu efectuarea biopsiei osoase; se pot efectua de asemenea punctia sternala la nivelul spatiului II intercostal (ce poate fi grevata insa de incidente majore, cum ar fi tamponada cardiaca si decesul pacientului) sau punctia spinei iliace antero-superioare/proceselor vertebrale spinoase in conditiile in care pacientul nu poate fi pozitionat pentru punctia spinei iliace postero-superioare sau zona respectiva este afectata prin iradiere/chirurgie anterioare. La copii maduva osoasa se poate obtine prin punctia ariei tibiale antero-mediale^1;2;3;5.

Recipient de recoltare – maduva este aspirata cu o seringa de plastic de 10-20 mL fara anticoagulant⁵.

Cantitate recoltata – 0.2-2 mL⁵.

Cauze de respingere a probei – frotiuri incorect efectuate/colorate⁵.

Prelucrare necesara dupa recoltare – din materialul aspirat se efectueaza rapid, inainte ca proba sa coaguleze, mai multe frotiuri. Se pot efectua frotiuri subtiri prin intindere, intr-un mod asemanator cu frotiurile de sange si/sau frotiuri cu grunji striviti (se dispune pe o lama de sticla o portiune din materialul medular care contine grunji, iar deasupra lui se aseaza o alta lama/lamela cu care acesta este tras spre capatul lamei), acestea din urma fiind preferate pentru examenul citologic al maduvei osoase, permitand totodata si o apreciere semicantitativa a celularitatii medulare^1;3;5. Se recomanda efectuarea a minim cinci frotiuri de maduva. Frotiurile se usuca in aer 30 minute; pentru examinarea morfologica a elementelor celulare si numararea acestora se coloreaza May-Grunwald-Giemsa; o parte din lame sunt pastrate necolorate pentru posibile coloratii speciale⁵.

Stabilitate proba – frotiurile fixate in metanol sunt stabile necolorate cel putin 1 an fara scaderea calitatii⁵.

Metoda – examinare microscopica initial la putere mica (obiectivul de 10x/20x) pentru aprecierea calitatii frotiului (prezenta de grunji, calitatea coloratiei, prezenta de artefacte), celularitatii si prezentei megakariocitelor; de asemenea celulele tumorale si granuloamele pot fi observate prin scanarea frotiului la putere mica^3;5. La examinarea cu obiectivul de putere mica frotiul medular cu grunji striviti colorat are o zona centrala de culoare inchisa reprezentata de grunjul medular, care contine celule stromale, adipocite, granulocite si multe celule distruse (nuclei liberi) si suprapuse, o zona periferica ce contine celule medulare diluate cu sange (ca si frotiurile subtiri efectuate prin intindere) si unde pot fi examinate detaliile morfologice ale celulelor izolate si o zona intermediara cu celularitate bogata, saraca in celule sanguine si celule adipoase si in care celulele medulare apar izolate sau grupate in insule/cuiburi si pastreaza intr-o oarecare masura relatiile arhitecturale din maduva; aceasta este zona care permite cel mai bine aprecierea semicantitativa a celularitatii medulare si evaluarea morfologica optima⁵. Megakariocitele se gasesc de obicei la limita dintre zona centrala si zona intemediara^3;5. Apoi frotiul se examineaza cu obiectivul de 100x cu imersie; trebuie evaluate minim 500 celule nucleate intacte, excluzandu-se nucleii liberi^3;4. Numaratoarea se efectueaza intr-o arie unde sunt prezenti putini nuclei liberi, celulele nu se suprapun, nu sunt grupate sau distorsionate. Aceasta este de obicei situata in zona celulelor dispersate adiacenta zonei centrale. De notat ca grunjii pot fi absenti in maduvele pediatrice si maduva va aparea ca o dispersie uniforma de celule³.

Valori de referinta – valorile de referinta pentru procentele diferitelor tipuri celulare medulare difera mult intre laboratoare si sunt utile doar orientativ pentru ceea ce se asteapta intr-o maduva normala. Un exemplu cu intervalele de referinta pentru numaratoarea celulelor medulare este prezentat in anexa 7.1.2³.

  

Semnificatie clinica

Frotiul medular este evaluat conform urmatoarelor criterii:

5. Celularitate: se apreciaza cel mai bine la nivelul zonei intermediare si se descriu urmatoarele aspecte: 1) maduva normocelulara; 2) maduva hipercelulara (cu numar mare de grunji si celularitate densa; maduva poate fi hipercelulara prin implicarea celulelor non-hematopoietice, iar hematopoieza sa fie de fapt redusa) si 3) maduva hipocelulara (cu grunji rari/absenti)⁵. Maduvele real hipocelulare reprezinta o conditie rara (hipoplazia/aplazia medulara). Astfel o maduva hipocelulara se poate datora unor defecte de tehnica (aspirarea de sange din sinusurile medulare), depinde de cantitatea de maduva extrasa (cu cat se aspira o cantitate mai mare de maduva contaminarea cu sange este mai mare) sau poate aparea in cazul in care maduva este compacta si celulele nu se desprind la aspiratie (unele leucemii acute) sau in prezenta mielofibrozei care impiedica aspirarea celulelor (metaplazie mieloida cu mielofibroza, mielofibroza secundara, hairy cell leukemia). Presupunerea unei reduceri reale a celularitatii medulare se bazeaza pe detectia neechivoca a unor piese medulare asociate cu grasime si celule stromale. Pacientii varstnici pot prezenta arii crescute de grasime¹. Specimenele contaminate cu sange contin multe eritrocite mature si putine elemente nucleate. Informatiile cele mai valoroase asupra celularitatii medulare sunt obtinute pe baza examenului histologic al biopsiei osteomedulare in care raportul intre spatiile grase si tesutul hematopoietic este de 1-2/1 la adultul normal, iar o maduva real hipocelulara este considerata cand apare o reducere a celularitatii <25%⁵.
6. Eritropoieza: Cel mai putin matur precursor eritroid care poate fi identificat in maduva este proeritroblastul (pronormoblastul), iar urmatoarele stadii de maturatie sunt reprezentate de eritroblastul (normoblastul) bazofil, eritroblastul (normoblastul) policromatofil si eritroblastul (normoblastul) ortocromatofil. Seria rosie este apreciata din punct de vedere cantitativ si calitativ.

Raportul granulo-eritroblastic (G/E) reprezinta raportul intre granulocitele neutrofile + precursorii lor si precursorii eritroizi si este de 2-4/1 la adultul normal, iar scaderea acestui raport se intalneste in hiperplazia eritroida (numar crescut de precursori eritroizi medulari) care insoteste diferite tipuri de anemii (anemie feripriva, anemie megaloblastica, anemie sideroblastica, talasemie). Raportul este marcat scazut/inversat in anemiile regenerative (posthemoragica/hemolitica). Cresterea raportului G/E indica fie hiperplazia seriei granulocitare, fie eritroblastopenie⁵.

Predominanta formelor policromatofile (~50%) si ortocromatofile (>30%) indica o maturatie normala a seriei rosii. Cresterea formelor bazofile (>20%) indica deficit de hemoglobinizare (anemia feripriva) sau apare in anemiile megaloblastice severe^4,5.

Anomalii ale seriei eritroblastice:

• Eritropoieza megaloblastica, care apare in deficitul de vitamina B12 sau acid folic, se caracterizeaza prin cresterea dimensiunii celulelor, cu cresterea raportului citoplasma/nucleu (citoplasma mai abundenta) si asincronism/disociere nucleo-citoplasmatica, cu nucleul avand un aspect imatur (heterocromatina redusa si paracromatina crescuta) in comparatie cu aspectul citoplasmei. Modificarile megaloblastice sunt mai evidente in stadiile de eritroblast policromatofil si eritroblast ortocromatofil timpuriu. De asemenea sunt prezente punctatii bazofile mari si corpi Howell-Jolly in citoplasma eritroblastilor mai maturi, anomalii nucleare, iar celulele in mitoza prezinta cromozomi mai lungi si mai ingusti decat in mod normal. Modificarile megaloblastice afecteaza si seria granulocitara, cu cresterea formelor imature, prezenta de metamielocite si nesegmentate gigante, segmentare prematura a nesegmentatelor, metamielocitelor si chiar mielocitelor, hipersegmentarea granulocitelor mature. Pot fi prezente megakariocite anormale, cu forme mature de dimensiuni crescute, cu numar mai mare de lobi nucleari distinct separati, precum si prezenta de forme mature mici, mono-/binucleate⁴.
• Modificari megaloblastoide (pseudo-megaloblastice) ale precursorilor eritroizi apar secundar unor cauze de obicei maligne: eritroleucemie si orice alta forma de leucemie acuta netratata/tratata, pre-leucemie, anemie refractara, hemoliza acuta, chimioterapie (6-mercaptopurina, citozin arabinozida etc.), medicamente imunosupresoare. Precursorii eritroizi megaloblastoizi prezinta modificari intermediare intre modificarile megaloblastice si precursorii eritroizi normali, iar precursorii mieloizi nu prezinta de obicei modificarile din conditiile megaloblastice primare. Alte anomalii prezente in conditiile megaloblastice si megaloblastoide in afara asincronismului nucleo-citoplasmatic includ: multilobulatia nucleara  (nuclei foldati, in forma de “frunza de trifoi” cu 3 sau 4 lobi) si multinuclearitatea cu nuclei de dimensiuni si maturatie diferite, protruziuni ale materialului nuclear in interiorul citoplasmei de dimensiuni diferite si care pot prezenta mici conexiuni filamentoase cu nucleul sau care se pot detasa de nucleu aparand ca mici nuclei multipli sau corpi Howell-Jolly, punti de cromatina intre nucleii eritroblastilor recent divizati (aspect de “pince-nez”), picnoza accelerata, kariorexis (fragmentare nucleara), mitoze anormale (numar crescut de cromozomi, mitoze multipolare), dezorganizarea si pierderea pattern-ului normal al cromatinei nucleare. Anomaliile citoplasmatice includ: vacuolizari ale citoplasmei prezente in special in eritroblastii mai tineri (in eritroleucemie, pre-leucemie, dupa expunerea la alcool si tratamentul cu cloramfenicol), eritrofagocitoza (de eritrocite mature/eritroblasti degenerativi) in eritroblasti (canibalism: in conditii megaloblastice netratate, eritroleucemie) sau in histiocite (in histiocitoza maligna, leucemia monocitara, anemii hemolitice, anemii megaloblastice, eritroleucemie)^4;5.
• Defecte de maturatie citoplasmatica caracterizeaza anemia feripriva, anemia din bolile cronice, anemiile sideroblastice si talasemia⁴. In anemia feripriva eritroblastii policromatofili si ortocromatofili pot fi mai mici decat in mod normal, cu citoplasma in cantitate mai mica, cu margine zdrentuita, neuniform colorata, cu asincronism nucleo-citoplasmatic: nucleu condensat caracteristic eritroblastilor ortocromatofili si citoplasma de culoare gri caracteristica eritroblastilor policromatofili^4;5. Aceasta sinteza inadecvata si intarziata de hemoglobina conduce la microcitele hipocrome din sange. Uneori nucleul formelor mai mature poate prezenta forme distorsionate, nucleu inmugurit/kariorexis. In anemiile sideroblastice pot exista precursori eritroizi cu modificari megaloblastoide ale cromatinei nucleare; anomaliile nucleare pot include picnoza accentuata si frecvente forme binucleate; anomaliile citoplasmatice includ citoplasma zdrentuita, distributie neuniforma a hemoglobinei, punctatii bazofile mari in eritroblastii mai maturi⁴.
• Oprirea in maturatie in stadiul de eritroblast bazofil, policromatofil/ortocromatofil cu disparitia concomitenta a reticulocitelor din circulatie indica un prognostic sever, de obicei o leucemie acuta incipienta⁵.

III. Granulopoieza: Precursorii granulocitari care pot fi identificati in maduva osoasa sunt mieloblastul, promielocitul, mielocitul neutrofil/eozinofil/bazofil si metamielocitul, care se gasesc alaturi de formele mature nesegmentate si segmentate neutrofile/eozinofile/bazofile. Celulele mieloide constituie elementul predominant din maduva, celulele mature fiind cele mai numeroase. Un numar crescut de celule imature indica de obicei un proces patologic³.

Anomalii ale seriei granulocitare:

• Metamielocite si nesegmentate gigante, segmentare precoce, granulocite hipersegmentate: caracteristice anemiei megaloblastice.
• Anomalia Pelger-Huet (hiposegmentarea nucleului granulocitelor: unul/doi lobi cu cromatina densa, condensata) congenitala sau dobandita (pseudo-Pelger-Huet) – frecventa in boli mieloproliferative (leucemii mieloide si mielo-monocitare, metaplazie mieloida), sindroame mielodisplazice; poate fi intalnita si in mixedem, infectii severe, metastaze, dupa colchicina, in leucemia limfocitara cronica⁴.
• Neutrofile hipo-/agranulare: boli mieloproliferative si mielodisplazice.
• Neutrofile cu granulatii toxice: infectii severe, reactii de faza acuta, administrarea de factori de crestere granulo-monocitari.
• Raport G/E crescut: infectii severe, reactie leucemoida, leucemie mieloida cronica. in aceasta din urma raportul G/E poate ajunge pana la 10-50/1, seria granulocitara prezentand morfologie si maturatie normala, uneori cu procent mai mare de mieloblasti (mai mare decat in sange), cu numar crescut de eozinofile si bazofile, putand fi prezente celule cu granulatii mixte; uneori numarul de mitoze poate fi crescut si sunt frecvente celulele rupte. In faza accelerata a leucemiei mieloide cronice cresc precursorii mieloizi, bazofilele, blastii si poate aparea anomalia pseudo-Pelger-Huet in neutrofile si eozinofile. Aceste modificari se accentueaza in faza blastica, in special cresterea procentului de blasti⁴.

4. Megakariopoieza: megakarioblastii nu pot fi de obicei recunoscuti cu usurinta pe frotiul medular; se pot identifica megakariocitele bazofile (10-15% din numarul total), megakariocitele granulare (60-70%) si megakariocitele trombocitogene (10-20%). Megakariocitele sunt celule foarte mari (30-150 µm), poliploide (8N, 16N, 32N etc.)⁴. Megakariocitele bazofile au citoplasma intens bazofila (numar crescut de ribozomi) indiferent de gradul de ploidie, iar nucleul este sferic, cu aspect tanar. Megakariocitele granulare au citoplasma rosie “ca vinul” datorita granulatiilor, iar nucleul este neregulat, cu numar variabil de lobi. Megakariocitele trombocitogene prezinta gruparea granulatiilor in viitoarele trombocite, trombocite adiacente la periferia lor, iar nucleul este mai mic si mai dens. Megakariocitele constituie tipul celular cel mai putin abundent din maduva, de obicei <1%³.

Anomalii ale megakariocitelor:

• Micromegakariocitele: celule mici, cu nucleu rotund/hipolobulat si citoplasma redusa cantitativ si putine granule – intalnite in conditiile cu turn-over trombocitar crescut (purpura trombocitopenica imuna), leucemia mieloida cronica, metaplazia mieloida^4;5.
• Micromegakariocite diploide: celule foarte mici (12-20 µm) asemanatoare celorlalte celule hematopoietice, cu nucleu mic, rotund, cu cromatina fina si citoplasma redusa cantitativ, granulara – caracteristice sindroamelor mielodisplazice⁵.
• Megakariocite gigante, numeroase, izolate/in cuiburi – in trombocitemia esentiala, metaplazia mieloida⁴.
• Megakariocite cu nucleu hiperlobulat, cu lobi inegali, “explodati”, avand cromatina fina – in anemia megaloblastica, sindroame mielodisplazice⁴.
• Megakariocite mari mononucleare, megakariocite cu nuclei multipli dispersati si megakariocite hipogranulare – in sindroamele mielodisplazice.
• Prezenta de neutrofile in citoplasma megakariocitelor (emperipolesis) care patrund pasiv prin sistemul membranelor de demarcatie⁵.

5. Limfociteleprezente in maduva sunt de obicei limfocite mici. Limfocitele si plasmocitele sunt celulele cele mai neuniform distribuite din maduva, limfocitele fiind dispuse uneori in noduli, iar plasmocitele in mansoane, perivascular^3;5. Limfocitele sunt crescute in limfocitozele reactive si sindroamele limfoproliferative.   Uneori pot fi intalnite in maduva normala plasmocite binucleate^4;5. Plasmocitele sunt crescute in plasmocitozele reactive, cand pot fi prezente plasmocite cu citoplasma “flambata”, cu corpi Russell sau cu cristale intracitoplasmatice si in mielomul multiplu⁴. In mielomul multiplu plasmocitele anormale prolifereaza in plin parenchim medular printre celelalte celule hematopoietice, spre deosebire de plasmocitozele reactive in care sunt dispuse perivascular⁵. Plasmocitele mielomatoase pot prezenta un spectru larg de aspecte ale citoplasmei si nucleului si grade diferite de maturitate, uneori chiar in acelasi specimen de maduva. Acestea au de obicei mai multa citoplasma decat plasmocitele normale, mai deschis colorata, frecvent cu vacuole, uneori cu granulatii rosii, nucleul rotund poate fi localizat mai central decat in plasmocitul normal, cromatina este de obicei mai putin condensata, frecvent cu nucleol vizibil, ocazional foarte mare, bizar/chiar doi nucleoli; in mielom sunt crescute plasmocitele binucleate sau cu mai multi nuclei, celulele “flambate” si plasmocitele cu corpi Russell⁴.
6. Monociteledin maduva sunt identice cu cele din sangele periferic. Macrofagele (histiocitele) medulare sunt celule mari, cu raport nucleu-citoplasma scazut, citoplasma cu contur neregulat, de culoare gri, cu numeroase granulatii mici rosu-purpurii si granulatii azurofile mai mari, numar variabil de particule ingerate (celule intregi/distruse, nuclei, granule de hemosiderina etc.) si vacuole, majoritatea la periferia celulei reflectand pinocitoza; nucleul este mic, oval, de obicei unic, dar poate fi multiplu, localizat excentric, cu cromatina uniform distribuita, cu cel putin un nucleol evident; histiocitele active au cromatina mai condensata.

• Eritrofagocitoza este crescuta in starile hemolitice, dupa transfuzii sau anumite medicamente. Digestia multor eritrocite determina degenerarea rapida a macrofagelor, care apar cu nucleul picnotic, cu cromatina indistincta si fara nucleol, iar citoplasma este vacuolata/spumoasa.
• Materiale straine in macrofagele: depozite crescute de fier (granulatii mari de hemosiderina care apar ca particule galben-aurii refractile intracitoplasmatice), purpura trombocitopenica imuna, hiperlipemie.
• Macrofage anormale sunt intalnite in maduva in: sindromul histiocitelor “albastre ca marea” (macrofage cu citoplasma albastru-stralucitor/albastru-verzui), boala Gaucher (macrofage cu incluzii lipidice, citoplasma cu aspect “in foi de ceapa”), boala Niemann-Pick (macrofage cu incluzii lipidice, citoplasma cu aspect spumos/”in fagure”), cistinoza (macrofage incarcate cu cristale birefringente). Celule pseudo-Gaucher/histiocite “albastre ca marea” pot fi uneori intalnite in conditii cu cantitati crescute de produsi de degradare: leucemii, in special leucemia mieloida cronica, limfoame, mielom, talasemie majora, cancer tratat, infectii virale, mononucleoza infectioasa, policitemia vera, lupus eritematos sistemic. De asemenea macrofage anormale sunt intalnite in infectii parazitare si fungice (histoplasmoza, candidoza), histiocitoza maligna, histiocitoza X⁴.

VII. Celulele non-hematopoietice care pot fi uneori observate pe frotiurile de maduva sunt: adipocite (in hipoplazia/aplazia medulara), celule stromale, celule reticulare, osteoblasti si osteoclasti (in special la copii si in maduva fetala osteoblastii trebuie diferentiati de plasmocite, iar osteoclastii de megakariocite sau de metastazele medulare)⁵, mastocite (in hipo-/aplazie medulara, limfoame, leucemie limfocitara cronica, boli infectioase, mastocitoza sistemica). In mod normal aceste celule reprezinta <1% din celularitatea medulara³.

VIII. Celulele atipice: pot fi reprezentate de celule blastice, celule mielomatoase, limfomatoase sau celule carcinomatoase.

  

Limite si interferente

1. Variatii fiziologice: la copii limfocitele sunt mai numeroase in maduva, in special la copiii pana la 4 ani unde pot costitui pana la 40% din celularitatea medulara; plasmocitele sunt rare la copii. In prima luna de viata celulele eritroide sunt proeminente datorita nivelurilor crescute de eritropoietina. De asemenea copiii tind sa aiba un numar mai mare de eozinofile si precursori eozinofilici³.
2. Evaluarea aspiratului medular ofera putine informatii privind celularitatea totala a maduvei osoase datorita fluctuatiilor in numararea elementelor celulare indusa de contaminarea cu sange periferic a specimenului medular. Evaluarea mai precisa a celularitatii medulare necesita examinarea histologica a biopsiei osteomedulare^1,3,4,5.
3.  Multe medicamente determina cresterea numarului de eozinofile medulare³.
4.  O maduva normala/non-diagnostica nu exclude posibilitatea unei boli localizate intr-o alta zona a maduvei².
5.  Vezi si limite si interferente pentru frotiul de sange periferic.

Bibliografie

1. Bartl R, Thomas L. Bone Marrow Examination. In Laboratory Clinical Diagnostics, First Edition, Frankfurt, 1998, 517-521.
2. DeMott W, Tilzer R. Hematology. In Laboratory Test Handbook, 3rd Edition, Hudson (Cleveland), 1994, 517-618.
3. Perkins S. Examination of the Blood and Bone Marrow. In Wintrobe’s Clinical Hematology, Philadelphia, 2004, 3-21.
4. Shafer J. Canadian Society of Laboratory Technologist Congress, Winnipeg, Manitoba, June 16 to 20, 1996, Workshop Manual, 7, 14-20, 22-23, 25-26, 29-33, 38, 41-42, 45-47, 61-62, 148-153, 157.
5. Ursea C, Examenul maduvei osoase. In Tratat de Medicina Interna, Hematologie, Partea a II-a, sub redactia Prof. Dr. Radu Paun, coordonator Prof. Dr. Dan Colita, Editura Medicala, 1999, 1028-1043