Imunofenotipare limfocitara-infectii cronice

Analize medicale

Laborator Synevo

 

Informatii generale

Multe infectii virale persista indefinit dupa faza acuta si pot avea consecinte clinice considerabile. Printre acestea se numara infectiile HBV, HCV, HIV si HTLV, ce sunt caracterizate prin niveluri crescute ale antigenelor persistente, prin afectarea localizarii tisulare a celulelor imune si perturbarea functiei celulelor T5.

Prin definitie, infectiile virale persistente nu sunt controlate in intregime de sistemul imun al gazdei. Functia alterata a celulelor T este ierarhica si pare sa se coreleze direct cu nivelul antigenic; include o productie scazuta de citokine si o capacitate proliferativa perturbata, pana la “epuizarea” completa a celulelor T implicate in raspunsul imun. Acest fenomen contrasteaza cu dezvoltarea normala a celulelor T cu memorie care se produce in absenta antigenului persistent2;5.

Procesul de “epuizare” a celulelor T, ca urmare a confruntarii continue cu niveluri moderate sau crescute de antigene virale exprimate pe numeroase celule, a fost descris initial la soarecii infectati cu virusul meningitei coriolimfocitare si s-a constatat ca se aplica si la infectiile HIV si HCV la om. Pana in acest moment, nu exista un raspuns definit la intrebarea daca “epuizarea” celulelor T este consecinta expunerii continue la concentratii crescute de antigen sau aceasta constituie cauza replicarii virale necontrolate si deci a incarcarii antigenice crescute.

La nivel molecular, “epuizarea” celulelor T este definita prin:

  • alterarea cailor de semnalizare prin TCR si citokine;
  • exprimarea de receptori inhibitori (PD-1, LAG-3, Tim3 etc.);
  • deficit metabolic si energetic;
  • alterarea maturatiei/diferentierii2.

Lipsa celulelor producatoare de IL-2 in cursul expunerii persistente la virusul HIV este o constatare deosebit de importanta in lumina studiilor recente privind dezvoltarea celulelor T cu memorie. Astfel, celulele de memorie CD4 si CD8 pot fi impartite in doua subtipuri, dupa functiile efectoare si capacitatea de migrare: celule T de memorie centrale CD45RA- care exprima markerii L-selectin (CD62L) si CCR7 si celule T de memorie efectoare CD45RA-care nu exprima acesti markeri si care migreaza catre situsurile replicarii virale din tesuturi. In ceea ce priveste productia de citokine, celulele T de memorie centrale produc in principal IL-2, in timp ce celulele T de memorie efectoare produc atat IL-2 cat si interferon gamma.

Persistenta antigenului la persoanele infectate cu HIV in faza de viremie este asociata cu un numar scazut de celule CD4+ de memorie centrale virus-specifice in comparatie cu persoanele ce au o viremie suprimata. Constatari similare au fost raportate si in infectia cronica cu virus C. Aceste studii arata ca expunerea cronica la antigen conduce la alterarea functionala a celulelor CD4 virus-specifice. Astfel, prezenta antigenului viral stimuleaza generarea de celule de memorie efectoare capabile sa produca interferon gamma dar care au o capacitate de proliferare redusa si o durata de viata scurta in vivo; in acelasi timp este perturbata dezvoltarea de celule de memorie centrale care au capacitate proliferativa si secreta IL-2; la randul lor, celulele de memorie efectoare scad nivelurile de antigen1.

Studiile care descriu un defect functional in celulele CD4+ virus-specifice ar putea explica lipsa functiei antivirale eficace a celulelor CD8+ in infectia HIV. Pentru un raspuns sustinut al celulelor CD8+ se pare ca este necesar ca limfocitele CD4+ sa furnizeze IL-2 (in cursul fazelor precoce ale infectiei cronice) si IL-21 (in cursul fazelor tardive). Exprimarea moleculei costimulatoare CD28 pe suprafata celulelor CD8+ antigen-specifice este posibil legata de productia de IL-2 de catre celulele CD4+. O alta modalitate prin care celulele T CD4+ contribuie la raspunsul sustinut al celulelor CD8+ in cazul infectiilor persistente este inductia continua si mentinerea productiei de anticorpi neutralizanti1;2.

Pe baza conceptului care prevede implicarea  mai multor mecanisme in reducerea raspunsurilor celulelor T CD8+ in cursul infectiilor virale cronice, au aparut posibilitati noi de interventii imunomodulatoare care se afla in curs de evaluare.

Unele comunicari au documentat reversarea in vitro a functiei celulelor T CD4+ izolate de la soarecii infectati cronic cu virusul coriomeningitei limfocitare, de la maimutele infectate cu virusul SIV sau de la oamenii infectati cu HIV sau HCV, prin blocarea unuia sau mai multor receptori inhibitori. Aceasta restaurare functionala a fost dependenta de cultura in vitro prelungita in prezenta anticorpilor blocanti respectivi si a fost precedata de proliferarea celulelor T CD8+. Inductia proliferarii in prezenta anticorpilor blocanti indreptati impotriva PD-1 rezulta intr-o apoptoza redusa precum si intr-o crestere atat a lungimii telomerelor cat si a activitatii telomerazei, ambele contribuind se pare la potentialul proliferativ crescut si la recuperarea functiilor efectoare2.

Imunofenotipare limfocitara – profil infectii cronice si recomandari pentru efectuarea acestui test

Profilul infectii cronice cuprinde urmatoarele celule exprimate in valoare procentuala si absoluta:

  • numarul de leucocite, granulocite, limfocite, monocite;
  • numarul total de celule T(CD3+);
  • celulele T naive CD45RA+, celulele T de memorie CD45RA- ;
  • celule T helper (CD4+);
  • celulele T naive CD45RA+ raportate la numarul de celule CD4+;
  • celule T CD31+;
  • celule T CD8+, celule T CD8+/CD28+ (citotoxice),  celule T CD8+/CD28- (reglatoare);
  • raport CD4+/CD8+;
  • celule  T imature (CD4+/CD8+);
  • celule B ( CD19+);
  • celule NK (CD16+/CD56+);
  • celule T activate (CD3+/HLA DR+).

Urmarirea tabloului imunofenotipal limfocitar este util in monitorizarea clinica a pacientilor cu infectii cronice in corelatie cu tratamentul administrat3.

Specimen recoltat  sange venos3. 

Recipient de recoltare – vacutainer ce contine EDTA ca anticoagulant3.

Volum proba – 5 mL sange3.

Stabilitate proba  sangele trebuie sa ajunga in maxim 24 ore la laboratorul la care se efectueaza testul si in aceasta perioada se pastreaza la temperatura camerei. Este contraindicata refrigerarea probei3.

Cauze de respingere a probei – specimene care au depasit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau congelate3.

Metoda – citometrie in flux3.

Valori de referinta si comunicarea rezultatelor

Buletinul final va contine intervalele de referinta pentru subseturile limfocitare adecvate varstei pacientului  impreuna cu o interpretare a rezultatelor obtinute3

Trebuie cunoscut faptul ca numarul absolut al populatiilor limfocitare este influentat de o serie de factori biologici, inclusiv hormoni, temperatura si mediul inconjurator. Studiile legate de variatiile circadiane au demonstrat o crestere progresiva a numarului de celule CD4+ in cursul zilei, in timp ce limfocitele CD8+ si limfocitele B CD19+ cresc doar in prima parte a zilei, fara a se modifica in cursul dupa-amiezei. Din acest motiv, atunci cand se efectueaza o monitorizare seriata a populatiilor limfocitare se recomanda ca probele de sange sa se recolteze in acelasi moment al zilei4.

In infectiile cronice se inregistreaza de obicei o granulocitopenie, o reducere a limfocitelor CD4+ si o inversare a raportului CD4/CD8.

Celulele T naive CD4+CD31+  reprezinta o subpopulatie a celulelor T CD4+ naive  recent eliberate din timus. Determinarea rezervei timice prin celule T naive CD31+ este utila in depistarea cauzei unei limfopenii persistente. Aceasta poate fi datorata unui “consum”crescut (indiciu de infectie cronica) sau unei “productii” scazute. Cu cat proportia de celule T CD31+ este mai mare cu atat capacitatea de generare a limfocitelor T naive este mai mare.

Raportul dintre celulele T naive si celulele T cu memorie scade in cursul vietii, deoarece se genereaza mereu noi celule cu memorie prin contactul cu antigenele. In infectiile cronice apare cresterea procentuala a celulelor T cu memorie CD45RA- ca urmare a activarii imune cronice3.

Bibliografie

  1. Cheryl L Day, Bruce D Walker. Progress in Defining CD4 Helper Cell Responses in Chronic Viral Infections. In J Exp Med, Vol. 198, No.12, December 2003.
  2. Helge Frebel, Kirsten Richter, Annette Oxenius. How chronic viral infections impact on antigen-specific T-cell responses. In European Journal of Immunology, 2010.
  3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.
  4. Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. T- and B-Cell Quantitation by Flow Cytometry. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
  5. Scott N. Mueller, Barry T. Immune responses to viruses. In Clinical Immunology. Principles and Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 426-427.

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată. Câmpurile obligatorii sunt marcate cu *