Fagotest activitate fagocitara neutrofile

Analize medicale

Laborator Synevo

 

Informatii generale si recomandari pentru efectuarea testului

Neutrofilele detin un rol important in raspunsul imun nespecific, in special in rezistenta antibacteriana,  ca celule efectoare, inductoare si reglatoare. Printre caracteristicile lor esentiale se numara:

  • marginatia si aderarea la celulele endoteliului vascular;
  • traversarea peretelui vascular (diapedeza) si migrarea catre focarele de inflamatie;
  • recunoasterea si fagocitarea moleculelor opsonizate;
  • degradarea si distrugerea acestor molecule prin generarea de radicali toxici de oxigen.

Aceste caracteristici sunt facilitate de prezenta de receptori aflati la suprafata si in interiorul celulelor, cum ar fi receptorii pentru citokine, neuromediatori, autacoizi si hormoni.

Chemotactismul neutrofilelor se produce ca raspuns la factorii chemotactici (chemotaxine) generati la nivelul focarului lezional. Mai mult, chemotaxinele intensifica metabolismul neutrofilelor, agregarea acestora si actiunile bactericide.

Fagocitoza este mediata de opsonine circulante, specifice (imunoglobuline IgG) sau nespecifice (componente ale complementului), neutrofilele avand receptori pentru fragmentul Fc al imunoglobulinelor IgG1, IgG2 si pentru fragmentul complementului iC3b (C3b inactivat). Microorganismele absorbite si opsonizate sunt distruse atat prin mecanisme oxigen-dependente cat si oxigen-independente. Radicalii liberi de oxigen degradeaza bacteriile absobite in fagozomi si sunt partial eliberati in mediul inconjurator unde intensifica distrugerea microorganismelor si determina simultan lezarea tesuturilor. Procesul este caracteristic inflamatiei acute, fiind mult mai rar intalnit in afectiunile inflamatorii cronice. Distrugerea microorganismelor se mai poate produce si prin intermediul proteinelor prezente in granulatiile azurofiele cum ar fi: catepsina G, lizozimul, interferonii etc.

Mediatorii inflamatiei, citokinele (de exemplu, TNFα) si selectinele cresc abilitatea granulocitelor de a se localiza la nivelul focarului de inflamatie. Capacitatea de fagocitoza este crescuta prin intensificarea productiei de radicali de oxigen si prin eliberarea enzimelor lizozomale. TNFα este un factor important care potenteaza activitatea fagocitara si citotoxica a neutrofilelor. La randul lor, granulocitele activate secreta citokine; IL-1 care stimuleaza productia de IL-8 de catre monocite, celule endoteliale si fibroblasti, creste expresia moleculelor de adeziune CD11b/CD18 si generarea de radicali de oxigen. Interferonul gamma este o citokina puternica care intensifica expresia receptorului Fc, stimuleaza modificarile oxigenului precum si eliberarea granulelor din neutrofile1.

Datorita caracteristicilor mentionate granulocitele sunt implicate in raspunsul inflamator precoce, iar anomaliile functionale ale acestora, survenite in oricare din etape, determina deficiente semnificative ale imunitatii celulare5.

Fagocitoza anormala poate sa apara in cazul unor defecte ale neutrofilului, ale imunoglobulinelor sau ale complementului. Cele mai cunoscute defecte mostenite sunt:

-disfunctia actinei din neutrofile (NAD): tulburare de motilitate a neutrofilelor indusa genetic ce determina reducerea marcata a capacitatii de migrare si de ingerare a particulelor;

-deficienta de tuftsina; tuftsina fiind implicata in stimularea fagocitozei, deficitul acesteia se asociaza cu perturbarea fagocitozei si susceptibilitate crescuta fata de infectii (germenii cel mai frecvent implicati: Staphylococus aureus, Streptococcus pneumoniae, Candida spp.); pacientii prezinta rash-uri asemanatoare dermatitei seboreice, adenopatii fluctuante, infectii respiratorii4;

-defectul receptorului pentru fragmentul complementului iC3b (CD11b) – rezulta dintr-o biosinteza anormala a unui lant beta de 95kDa (CD18) care este comun receptorului iC3b si moleculelor de adeziune LFA-1, Mac-1 si CR4; anomalia a fost denumita defectul de adeziune leucocitara tip 1 (LAD-1), se transmite autozomal recesiv si se caracterizeaza clinic prin ulcere cutanate cronice/recurente, gingivita, fistule intestinale sau perianale; functiile leucocitare (marginatia, chemotactismul, opsonizarea mediata prin iC3b si fagocitoza) sunt sever afectate2.

O activitate fagocitara redusa poate fi intalnita si in unele afectiuni dobandite cum ar fi traumatismele, diabetul zaharat si infectiile (plagi infectate dupa arsuri, SIDA, infectii survenite la nou-nascuti sau varstnici).

Activitatea fagocitara a neutrofilelor si monocitelor poate fi stimulata de preparate imunomodulatoare: citokine (interleukina-2, gamma-interferon), probiotice sau extracte de plante (Echinaceae purpureae herba).

Fagotestul are ca scop investigarea activitatii fagocitare in diverse afectiuni si evaluarea efectelor exercitate de medicamente3.

Pregatire pacient – se va evita recoltarea probei in cursul unei infectii acute3.

Specimen recoltat  sange venos3. 

Recipient de recoltare – vacutainer cu heparinat de litiu3.

Volum proba – minim 2 mL sange heparinat3.

Stabilitate proba  sangele trebuie sa ajunga in maxim 24 ore la laboratorul la care se efectueaza testul si in aceasta perioada se pastreaza la temperatura camerei. Este contraindicata refrigerarea probei3.

Cauze de respingere a probei – specimene care au depasit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau congelate3.

Metoda – citometrie in flux.

Fagotest permite evaluarea cantitativa a fagocitozei prin masurarea procentului de fagocite care au ingerat bacterii si a activitatii acestora (numar de bacterii/celula). Se utilizeaza bacterii (E. coli) opsonizate marcate cu fluoresceina (FITC-E. coli) care se incubeaza impreuna cu sangele pacientului la 37°C; se utilizeaza si o proba cu rol de control negativ care se mentine pe gheata; ulterior, fagocitoza este oprita prin plasarea probelor pe gheata si adaugarea solutiei de stopare; aceasta solutie permite diferentierea intre atasarea si internalizarea bacteriilor prin eliminarea fluorescentei bacteriilor legate de suprafata celulelor si mentinand nealterata fluorescenta particulelor internalizate; dupa doua etape de spalare se indeparteaza eritrocitele cu ajutorul solutiei de liza; solutia de colorare a ADN-ului, adaugata inaintea analizei prin citometrie in flux, exclude artefactele generate de agregatele bacteriene care au proprietati de dispersare a luminii asemanatoare leucocitelor; se utilizeaza un laser cu argon (488 nm, lumina albastra); pentru fiecare proba se colecteaza prin “gating”  10000-15000 leucocite; sunt analizate atat procentul de celule (neutrofile si monocite) care au fagocitat bacterii, cat si intensitatea medie a fluorescentei acestora (numarul de bacterii ingerate); in acest scop se va efectua un “gating” pe grupul leucocitar relevant si se va analiza histograma fluorescentei verzi a acestuia (FL1); prin utilizarea controlului negativ se va seta un marker pentru fluorescenta-1 (FL1), astfel incat sub 1% din evenimente sa fie pozitive; procentul de celule care fagociteaza bacterii va putea fi apoi determinat prin numararea evenimentelor localizate deasupra marker-ului; intensitatea medie a fluorescentei se coreleaza cu numarul de bacterii ingerate de catre un singur leucocit3.

Valori de referinta si comunicarea rezultatelor

Sunt raportati urmatorii parametri:

Procentul de neutrofile care fagociteaza bacterii: >84%

Activitate fagocitara neutrofile: >550 mfi

mfi = intenistatea medie a fluorescentei3.

Limite

Probele cu un numar de leucocite aflat in afara intervalului de referinta necesita o corectie a cantitatii de bacterii adaugate3.

Bibliografie

  1. Anatol Panasiuk, Jolanta Wysoka, Elzbieta Maciorkowska, Bozena Panasiuk, Danuta Prokopowicz, Janusz Zak, Karol Radomski. Phagocytic and oxidative burst activity of neutrophils in the end stage of liver cirrhosis. In World Journal of Gastroenterology 2005; 11(48):7661-7665.
  2. Francesco Dati & Erwin Metzmann. Immunodeficiencies: Characteristics and laboratory findings. In Proteins Laboratory Testing and Clinical Use, Media Print Taunusdruck GmbH, Frankfurt am Main; 2005,186.
  3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2011. Ref Type: Catalog.
  4. Lawrence A. Schachner, Ronald C. Hansen. Genodermatoses. In Pediatric Dermatology, 3d edition, 2003, Mosby, 314.
  5. Roger S. Riley, Jonathan Ben-Ezra. Laboratory Evaluation of the Cellular Immune System. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Saunders-Elsevier, 21st Edition, 826-830.

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată. Câmpurile obligatorii sunt marcate cu *