Distrofia musculara Duchenne/Becker (deletii/duplicatii MLPA)

Laborator Synevo

 

Informatii generale

Distrofinopatiile includ un spectru de boli musculare cauzate de mutatii ale genei DMD care codifica distrofina. Formele clinice de boala au severitate variabila si prezinta o transmitere legata de cromozomul X; cele mai usoare fenotipuri includ cresterea asimptomatica a activitatii creatinkinazei serice, crampe musculare insotite de mioglobinurie si miopatie de cvadriceps izolata; la polul opus se situeaza afectiunile musculare progresive clasificate in doua mari categorii: distrofia musculara Duchenne/Becker, atunci cand sunt afectati in principal muschii scheletici, si cardiomiopatia dilatativa asociata cu mutatii DMD, atunci cand afectarea cardiaca este pe primul plan¹.

Distrofia musculara Duchenne este cea mai frecventa forma de distrofie musculara ce afecteaza 1 din 3500 baieti. Manifestarile clinice debuteaza in prima copilarie cu dificultati in invatarea miscarilor, alergare, urcatul scarilor si ridicarea de la sol. Mersul este leganat sau pe varfuri si exista o tendinta marcata de cadere. Boala progreseaza rapid, astfel ca in jurul varstei de 12 ani copiii isi pierd capacitatea de a merge si devin imobilizati in scaunul cu rotile. Reducerea performantelor intelectuale este inregistrata in aproximativ 30% dintre cazuri. Complicatiile cardiace (cardiomiopatia) apar dupa varsta de 18 ani si reprezinta, impreuna cu tulburarile respiratorii, principala cauza de deces. Rata de supravietuire este foarte redusa dupa decada a treia de viata. In 1986 Duchenne a stabilit criteriile de diagnostic ale bolii care sunt inca folosite: slabiciune ce debuteaza la nivelul membrelor inferioare; hiperlordoza si mers cu baza de sustinere largita; hipertrofia muschilor gambei; evolutie progresiva in timp; reducerea contractilitatii musculare la stimularea electrica; absenta disfunctiilor sfincteriene si a starii febrile. Gowers a fost primul care a dedus baza genetica a acestei afectiuni si a descris unii pacienti cu debut tardiv al manifestarilor clinice. In 1962 Becker a considerat ca pacientii cu un fenotip mai putin sever de boala prezinta de fapt mutatii mai usoare la nivelul aceleiasi gene. In prezent acestia sunt incadrati in distrofia musculara Becker^1;4.

In 1986 Kunkel a identificat gena distrofiei musculare Duchenne ca fiind localizata la nivelul benzii Xp21 si a confirmat astfel modul de transmitere X-linkata a bolii.

Distrofia musculara Becker are o prevalenta de 24 cazuri la un 1 milion si are de asemenea o transmitere legata de cromozomul X. Fenotipul este generat de mutatii genetice diferite de cele implicate in maladia Duchenne insa gena afectata este comuna (DMD). Distrofia Becker debuteaza clinic la o varsta mai mare si inregistreaza o evolutie clinica mai lenta. Imobilizarea in scaunul cu rotile se produce dupa varsta de 20 ani; desi afectarea musculaturii scheletice este mai putin severa decat in boala Duchenne, insuficienta cardiaca generata de cardiomiopatia dilatativa este o cauza importanta de morbiditate si mortalitate.

Ca urmare a transmiterii X-linkate, atat boala Duchenne cat si boala Becker se manifesta aproape in exclusivitate numai la baieti. Foarte rar femei purtatoare de mutatii DMD dezvolta fenotip Duchenne/Becker ca urmare a inactivarii intamplatoare a cromozomului X neafectat, asocierii sindromului Turner (X0) sau a unei disomii uniparentale. Astfel, in majoritatea cazurilor femeile sunt asimptomatice, iar doua treimi dintre acestea prezinta cresteri ale activitatii creatinkinazei⁴.

Cardiomiopatia dilatativa asociata cu mutatii ale genei DMD se caracterizeaza prin dilatarea ventriculului stang si insuficienta cardiaca congestiva. La sexul masculin boala debuteaza clinic la varste cuprinse intre 20 si 40 ani si are o evolutie rapida letala in timp ce la femei se inregistreaza un debut mai tardiv si o progresie mai lenta. De obicei lipsesc semnele si simptomele afectarii musculaturii scheletice.

DMD este singura gena asociata cu distrofinopatiile. Testele de biologie moleculara care evidentiaza mutatiile DMD pot stabili diagnosticul in majoritatea cazurilor de distrofie Duchenne sau Becker, fara a fi necesara biopsia musculara. Teoretic toti pacientii de sex masculin cu distrofie Duchenne si cel putin 85% dintre cei cu distrofie Becker prezinta mutatii DMD identificabile. Numarul pacientilor cu cardiomiopatie dilatativa si mutatii DMD identificabile este necunoscut. In restul cazurilor, coroborarea datelor clinice cu istoricul familial, nivelul creatinkinazei serice, biopsia musculara si analiza distrofinei confirma diagnosticul¹.

DMD este cea mai mare gena identificata in genomul uman; este alcatuita din 79 exoni si are o rata inalta de mutatii; se exprima in principal la nivelul musculaturii scheletice, netede si cardiace. Proteina codificata – distrofina – este implicata in legatura mecanica dintre matricea extracelulara si citoscheletul celular. In absenta distrofinei este afectata integritatea sarcolemei si este perturbata stabilitatea fibrei musculare. Deoarece creste susceptibilitatea fata de injuriile mecanice, fibrele musculare vor suferi cicluri repetate de necroza si regenerare cu epuizarea in final a capacitatii de regenerare. Mutatiile DMD care provoaca fie absenta completa a distrofinei, fie producerea unei proteine trunchiate sunt asociate cu fenotipul Duchenne. Pe de alta parte,  mutatiile care afecteaza regiunea de mijloc a genei vor genera o proteina mai scurta care insa isi conserva domeniile carboxi- si aminoterminale si implicit functionalitatea; acestea sunt asociate cu fenotipul Becker^2;4.

Deletiile mari care implica unul sau multi exoni sunt responsabile de aproximativ 59% din cazurile de boala Duchenne si 65% din cele de distrofie Becker. Mutatiile care induc aparitia prematura a unui codon stop sunt intalnite in 15% din cazuri, iar duplicatiile in 5% din cazuri; in restul cazurilor sunt intalnite mutatii ale cadrului de citire, insertii/deletii, mutatii ale situsului de splicing, precum si mutatii missens.

Desi aproape toate cazurile de distrofie Duchenne sau Becker se transmit X-linkat, in o treime din cazuri nu exista istoric familial, fiind vorba de mutatii de novo. Mozaicismul gonadal este responsabil de aproximativ 20% dintre cazurile noi de distrofie musculara Duchenne⁴.

Riscul ca fratii unei persoane afectate sa dezvolte boala depinde de starea de purtator a mamei. Datorita transmiterii X-linkate a distrofinopatiilor femeile purtatoare prezinta un risc de 50% de a transmite mutatia DMD la fiecare sarcina. Fiii care mostenesc mutatia vor fi intotdeauna afectati, in timp ce fiicele care mostenesc mutatia vor fi purtatoare si pot sau nu sa dezvolte cardiomiopatie.

De obicei persoanele de sex masculin cu distrofie Duchenne sufera decesul inaintea varstei reproductive, in timp ce barbatii cu fenotip Becker se pot reproduce, astfel ca toate fiicele lor vor mosteni mutatia cauzatoare de boala, iar fii lor nu vor fi afectati.

Matusile pe linie materna ale persoanei afectate, cat si copiii acestora pot prezenta un risc crescut de a face boala sau de a deveni purtatori in functie de sexul acestora, relatiile familiale si starea de purtator a mamei.

O femeie cu un fiu afectat si cu o alta ruda afectata pe linie materna este obligatoriu heterozigota pentru o mutatie DMD.

O femeie cu mai mult de un fiu afectat si cu istoric familial negativ prezinta fie o mutatie a liniei germinale (mutatia DMD cauzatoare de boala este prezenta in toate celulele sale), fie un mozaicism gonadal (mozaicismul pentru o mutatie DMD cauzatore de boala este prezent numai in linia germinala).

Daca fiul cu afectiune Duchenne/Becker reprezinta  singurul membru afectat din familie trebuie luate in considerare mai multe posibilitati legate de statusul de purtator al mamei:

1. a) fiul afectat prezinta o mutatie de novocare a rezultat din:

• o mutatie suferita in momentul conceptiei care este prezenta astfel in toate celulele  sale; in acest caz mama nu este purtatoare si nici un alt membru al familiei nu prezinta risc;
• o mutatie  suferita dupa conceptie care este astfel prezenta doar in anumite celule (mozaicism somatic); in acest caz probabilitatea ca mama sa fie purtatoare este redusa.

1. b) mama prezinta o mutatie de novo; aproximativ doua treimi din mamele baietilor afectati de distrofie Duchenne/Becker si fara istoric familial sunt purtatoare de mutatii DMD; mecanismele prin care apar mutatii de novola mama sunt urmatoarele:

•  mutatia s-a produs in momentul conceptiei si este prezenta astfel in toate celulele  sale (mutatie a liniei germinale) fiind detectabila in ADN-ul extras din leucocite;
•   mutatia a survenit dupa conceptie si este astfel prezenta doar in anumite celule (mozaicism somatic), fiind detectabila sau nu in ADN-ul extras din leucocite;
•  mutatia este prezenta doar in celulele  sale sexuale (mozaicism gonadal) si nu este astfel detectabila in ADN-ul extras din leucocite; prin urmare fiecare copil al sau are riscul de a mosteni mutatia DMD cauzatoare de boala.

1. c) mama a mostenit o mutatie de la:

• mama care este purtatoare;
• mama sau tata cu mozaicism somatic;                                   
•  mama sau tata cu mozaicism gonadal.         

Testarea genetica combinata cu analiza de linkaj poate stabili adesea originea unei mutatii de novo. Aceasta analiza este importanta pentru identificarea acelei ramuri familiale care prezinta risc crescut de distrofinopatii¹.

Au fost dezvoltate mai multe tehnici de biologie moleculara pentru depistarea mutatiilor genei DMD in probe de sange periferic, printre care se numara:

-multiplex PCR pentru detectarea deletiilor (rata de detectie ~ 95%);

-Southern blot si PCR cantitativ pentru detectarea duplicatiilor;

-MHPA (Multiplex Amplifiable Probe Hybridization) si MLPA (Multiple Ligation Probe Amplification) pentru analiza deletiilor/duplicatiilor;

-secventierea completa a genei DMD pentru detectarea mutatiilor punctiforme, a deletiilor si insertiilor mici, a mutatiilor situsului de splicing^1;4.

Tehnica MLPA pentru gena DMD necesita doua tipuri de reactii diferite datorita numarului mare de exoni. O reactie include un amestec de sonde denumit PO34 ce acopera exonii 1-10, 21-30, 41-50, si 61-70. Cea de a doua reactie contine un amestec de sonde denumit PO35 ce acopera analiza exonilor  11-20, 31-40, 51-60 si 71-79. Studiile efectuate dovedesc ca aceasta tehnica ce „scaneaza” simultan toti cei 79 exoni ai genei DMD pentru prezenta deletiilor/duplicatiilor reprezinta un instrument util de diagnostic atat in cazul persoanelor de sex masculin afectate cat si al femeilor purtatoare^2;5.

Recomandari pentru testarea genetica

-confirmarea diagnosticului de distrofie Duchenne/Becker la persoanele afectate;

-testarea rudelor cu risc crescut pentru identificarea femeilor purtatoare; ideal este sa se identifice in prealabil o mutatie cauzatoare de boala in familie;

-diagnosticul prenatal la gravidele cu risc crescut pentru o mutatie DMD; se efectueaza prin analiza ADN-ului extras din celulele fetale obtinute prin amniocenteza, de obicei efectuata la aproximativ 15-18 saptamani de gestatie sau biopsia vilozitatilor coriale, la aproximativ 10-12 saptamani de gestatie; mutatiile cauzatoare de boala trebuie sa fie identificate inainte de testarea prenatala^1;3;4.

Specimen recoltat – sange venos³.

Recipient de recoltare – vacutainer ce contine EDTA ca anticoagulant³.

Cantitate recoltata –  5 mL sange³.

Cauze de respingere a probei – folosirea heparinei ca anticoagulant; probe coagulate sau hemolizate³.

Stabilitate proba – 7 zile la 2-8ºC³.

Metode – analiza deletiilor/duplicatiilor MLPA³. 

Raportarea si interpretarea rezultatelor

Vor fi comunicate deletiile/duplicatiile depistate in gena DMD si asocierea lor cu un fenotip Duchenne/Becker conform datelor din literatura de specialitate³.

Identificarea unei mutatii cauzatoare de boala la o persoana de sex masculin cu tablou clinic sugestiv si niveluri crescute de CK confirma diagnosticul. Fenotipurile Duchenne/Becker se coreleaza cel mai bine cu gradul de expresie a distrofinei ce este determinata de cadrul de citire al ARN-ului mesager obtinut din alela mutanta. Astfel, deletiile foarte mari pot conduce la absenta expresiei distrofinei; de asemenea unele deletii si duplicatii pot altera cadrul de citire si determina productia unei proteine sever trunchiate ce se asociaza cu fenotipul Duchenne. Fenotipul Becker se dezvolta atunci cand se mentine o anumita productie de distrofina care isi conserva partial functia; in aceste cazuri este vorba de deletii sau duplicatii care juxtapun unii exoni de la nivelul cadrul de citire.

In familiile in care persoana de sex masculin afectata prezinta o deletie sau duplicatie DMD cunoscuta, aceasta modificare este cautata si la rudele cu risc crescut. Absenta modificarii exclude starea de purtator. Identificarea unei mutatii DMD confirma starea de purtator; deoarece femeile purtatoare prezinta un risc crescut de a dezvolta cardiomiopatie, se recomanda o evaluare cardiaca completa cel putin o data la 5 ani, dupa varsta de 25-30 ani¹.

Limite si interferente

Un rezultat negativ pentru o mutatie DMD la testul MLPA nu exclude diagnosticul la persoanele cu tablou clinic sugestiv. Avand in vedere faptul ca in 25-30% din cazurile de distrofie musculara Duchenne-Becker sunt implicate mutatii punctiforme, se recomanda secventierea completa a genei DMD.

In familiile in care mutatia DMD nu este cunoscuta, obtinerea unui rezultat negativ la testul MLPA pentru femeile cu risc crescut nu exclude starea de purtator. Prezenta unui istoric familial pozitiv impune secventierea intregii gene^1;3;4.

Bibliografie

1. Basil T Darras, Bruce R Korf, David K Urion. Dystrophinopaties. Gene Reviews, 2008. www.ncbi.nlm.nih.gov. Reference Type: Internet Communication.
2. D.M. Marzese, A. Mampel, L.C. Gomez, M.I. Echeverria, A.L. Vargas, V. Ferreiro, F. Giliberto and M. Roqué. Detection of deletions and duplications in the Duchenne muscular dystrophy gene by the molecular method MLPA in the first Argentine affected families. In Genet. Mol. Res. 7 (1): 223-233 (2008).
3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2011. Ref Type: Catalog. 4. Michelle L Mellion, Brian S Tseng. Dystrophinopaties. www.emedicine.medscape.com, Ref Type: Internet Communication.
4. Tanja Lalic, Rolf HAM Vossen, Jordy Coffa, Jan P Schouten, Marija Guc-Scekic, Danijela Radivojevic, Marina Djurisic, Marty¨n H Breuning, Stefan J White and Johan T den Dunnen. Deletion and duplication screening in the DMD gene using MLPA. In European Journal of Human Genetics (2005) 13, 1231–1234.