Laborator Synevo
Informaţii generale
Scleroza sistemică face parte din colagenoze, boli de natură autoimună ale ţesutului conjunctiv, care afectează organele interne şi pielea. 2-50 din 100.000 indivizi suferă de scleroză sistemică în întreaga lume. Boala apare în principal la adulţii de vârstă mijlocie, fiind de 3-4 ori mai frecventă la femei.
Riscul de a dobândi această boală este mai mare la populaţia neagră. Scurtarea frenului lingual, sindromul Raynaud (stadiul 1: ischemia mâinilor şi picioarelor; stadiul 2: cianoza locală cauzată de hipoxie; stadiul 3: hiperemie reactivă), poliartralgiile şi poliartritele sunt cele mai precoce semne de scleroză sistemică. Într-o etapă ulterioară pacienţii dezvoltă edeme la nivelul mâinilor şi picioarelor, pielea devine rigidă, îngroşată şi în stadiile finale atrofică, ceroasă şi subţire. Apar de asemenea deformări ale mâinilor iar degetele rămân fixate într-o poziţie îndoită. Musculatura feţei devine rigidă (aspect de “icoană bizantină”), ceea ce conduce la microstomie şi tulburări de închidere a fantei palpebrale. În final se dezvoltă fibroza organelor viscerale (tractul digestiv, inima, plămânii, rinichii) şi a vaselor sanguine ca urmare a depozitelor excesive de colagen. Insuficienţa cardiacă asociată cu hipertensiune pulmonară şi fibroză cardiacă reprezintă principala cauză de deces în scleroza sistemică.
În funcţie de distribuţia cutanată sunt descrise două forme de scleroză sistemică:
– limitată, cu o evoluţie mai lentă, în care leziunile cutanate sunt distribuite la nivelul extremităţilor distale;
– difuză, în care leziunile sunt distribuite difuz la nivelul trunchiului şi feţei.
Sindromul CREST constituie un subtip de scleroză sistemică caracterizat clinic prin: calcificări cutanate, sindrom Raynaud, tulburări de motilitate a esofagului, sclerodactilie şi telangiectazii.
Criteriile de clasificare elaborate de ACR (American College of Rheumatology) pentru scleroza sistemică sunt următoarele:
- Criteriu major: afectarea cutanată care se extinde proximal către articulaţiile metacarpofalangiene sau metatarsofalangiene;
- Criterii minore: sclerodactilie; cicatrici erozive ale pulpei degetelor; fibroză pulmonară bazală bilaterală.
Pentru stabilirea diagnosticului este necesară prezenta criteriului major sau a două criterii minore2;3. Deoarece criteriile ACR au fost elaborate în scop de clasificare şi nu de diagnostic, în practică sunt general acceptate criteriile LeRoy şi Medsger care prezintă o sensibilitate crescută şi permit un diagnostic precoce4:
|
Forma difuză (ScS-d) |
Forma limitată (ScS-l) |
|
Afectare cutanată proximală şi a trunchiului; apariţia recentă a sindromului Raynaud (~ 1 an), fricţiuni la nivelul tendoanelor |
Afectare cutanată distală (mâini, antebraţe, faţă) sau absentă; prezenţa îndelungată (ani) a sindromului Raynaud |
|
Modificarea capilarelor la nivelul patului unghial, cu distrucţie capilară |
Dilataţii capilare la nivelul patului unghial, fără distrucţii |
|
Pozitivitatea Ac anti-topoizomerază (~ 30%); absenţa anticorpilor anti-centromerici (ACA) |
Incidenţă mare a ACA |
|
Afectare precoce prin fibroză pulmonară, insuficienţă renală, afectare miocardică, afectare gastrointestinală difuză |
Hiprtensiune pulmonară (tardiv), calcinoză, telangiectazii |
Testul ANA – imunofluorescenţă indirectă este pozitiv la ≥ 90% dintre pacienţii cu sclerozăsistemică. Determinarea autoanticorpilor specifici reprezintă un element important pentru diagnosticul serologic al sclerozei sistemice (inclusiv în stadii precoce), monitorizarea evoluţiei bolii, estimarea prognosticuuil şi diferenţierea de alte colagenoze1.
Anticorpii anti-Scl-70 sunt îndreptaţi împotriva unei proteine non-histonice de 70 kDa, izolată iniţial din nuclei de celule hepatice provenite de la şobolan. Ulterior, s-a demonstrat că această proteină este un produs de degradare al ADN topoizomerazei I, o clasă de enzime localizate în nucleoplasmă şi nucleoli, având funcţia de a menţine integritatea informaţională a ADN (prin capacitatea de a scinda şi de a reuni la loc unul din cele două lanţuri ADN).
Anticorpii anti-Scl-70 se găsesc la 40% din pacienţii cu scleroză sistemică forma difuză şi la 10% din pacienţii cu scleroză sistemică forma limitată. Prezenţa anti-Scl-70 se asociază, în majoritatea cazurilor, cu o evoluţie severă şi rapidă a bolii, cu afectarea extensivă a teritoriului cutanat şi a organelor interne.
Ca şi în cazul anticorpilor anti-centromer prezenţa anticorpilor anti-Scl-70 la pacienţii cu sindrom Raynaud poate fi un factor predictiv pentru dezvoltarea ulterioară a sclerozei sistemice. Anticorpii anti-Scl 70 se asociază cu alela DRB1*11 în toate grupurile etnice1;2;3.
Anticorpii anti-centromer au fost descrişi cu pattern-ul caracteristic o dată cu introducerea substratului Hep2 în tehnica de imunofluorescenţă indirectă, ceea ce nu a fost posibil utilizând ţesuturile animale. Anticorpii sunt îndreptaţi împotriva a 6 proteine centromerice (A-F) localizate în zona de ancorare a fibrelor fusului mitotic în cursul mitozei.Toate serurile care conţin anticorpi anti-centromer reacţionează cu CENP-B (80 kDa).
Anticorpii anti-CENP B constituie un marker serologic pentru sindromul CREST, un subtip de scleroză sistemică
(prevalenţă 70-90%). Acest tip de autoanticorpi mai poate apărea în sindromul Raynaud şi în ciroza biliară
primitivă.
Studiile clinice au arătat că pacienţii cu scleroză sistemică având anticorpi anti–centromer pozitivi şi anti-Scl 70 negativi prezintă o rată de supravieţuire la 10 ani cu mult mai bună. În general, prezenţa anticorpilor anti-centromer determină un prognostic mai bun al bolii decât alţi autoanticorpi asociaţi cu scleroza sistemică. Frecventa anticorpilor anti-centromer la pacienţii cu scleroză sistemică poate varia în funcţie de originea etnică (crescută la caucazieni, scăzută la hispanici şi afro-americani)1;3;5.
Anticorpii anti-ARN-polimeraza III (RNAP III) se întâlnesc împreună cu anti-RNAP I şi anti-RNAP II la 20% din pacienţii cu scleroză sistemică, având valoare diagnostică şi prognostică. Specificitatea anti-RNAP III şi RNAP I este similară însă mai bună decât cea a anticorpilor anti-RNAP II, aceştia din urmă putându-se întâlni în sindroame de tip overlap LES/scleroză sistemică. Anticorpii anti-RNAP I şi anti-RNAP III coexistă întotdeauna. Anticorpii anti-RNAP apar mai frecvent în forma difuză a sclerozei sistemice şi sunt îndreptaţi împotriva unor proteine nucleolare şi nucleare. Complexul RNAP I este localizat în nucleoli, în timp ce proteinele RNAP II şi III se găsesc în nucleoplasmă.
Anticorpii anti-fibrilarină (anti-U3RNP) sunt îndreptaţi împotriva unei proteine de 34 kDa, subunitate a familiei de proteine snRNP (ribonucleoproteine nucleare mici) implicate în procesarea ARN-ului mesager. Anticorpii anti-fibrilarină apar la aproximativ 4% din pacienţii cu scleroză sistemică, fiind specifici pentru forma difuză de boală şi asociindu-se cu manifestările de miozită, hipertensiune pulmonară şi afectare renală.
Aceşti autoanticorpi au mai fost descrişi şi la pacienti cu LES, boală mixtă de ţesut conjunctiv şi sindrom Raynaud.
Anticorpii anti-Th/To au fost identificaţi mai recent şi sunt îndreptaţi împotriva componentelor ribonucleoproteazei MRP şi complexului ribonucleazei P, care se găsesc la nivelul nucleolului. Anticorpii Th/To sunt prezenţi la 2-5% din pacienţii cu scleroză sistemică, fiind mai frecvenţi în populaţia japoneză. De asemenea, aceşti anticorpi au fost descrişi la pacienţi cu LES, sindrom Raynaud şi polimiozită. Anticorpii anti-Th/To nu se asociază în general cu anticorpii anti-centromer1;2.
Anticorpii anti-NOR 90 recunosc un component de 90kDa al regiunii cromozomiale în jurul căreia se formează nucleolul (Nucleolus organizer region). Antigenul NOR 90 a mai fost descris şi ca hUBF (human upstream binding factor) cu 2 izoforme – factorul de transcriptie al ARN polimerazei I. Anti-NOR 90 sunt întâlniţi la pacienţi cu scleroză sistemică, sindrom Raynaud, LES, artrită reumatoidă si diferite malignităţi2.
Anticorpii anti PM-Scl sunt îndreptaţi împotriva proteinelor complexului nucleolar PM-Scl, compus din 11-16 polipeptide în care componentele antigenice au greutăţi moleculare cuprinse între 20 kDa şi 110 kDa. Principalele antigene sunt 2 polipeptide de 75 şi respectiv 100 kDa, cunoscute ca PM-Scl 75 şi PM-Scl 100. Cele 2 antigene sunt independente unul de celălat şi nu reacţionează încrucişat. Acest complex de proteine este implicat în biosinteza ribozomilor. Anticorpii anti-PM-Scl se asociază frecvent cu sindroamele overlap sclerodermie-polimiozită/dermatomiozită.
Anticorpii anti-Ku sunt îndreptaţi împotriva unui antigen proteic nucleolar de tip heterodimer, compus din două subunităţi cu masa moleculară de 70 şi respectiv 80 kDa, component al unui complex enzimatic al proteinkinazei dependente de ADN. Acest complex deţine un rol important în procese celulare legate de translaţie, repararea ADN-ului şi rearanjarea genelor implicate în sinteza imunoglobulinelor, precum şi a receptorilor celulelor T. Anticorpii anti-Ku sunt întâlniţi într-un spectru larg de boli ale ţesutului conjunctiv, în special sindroame overlap sclerodermie-miozită, dar şi LES (3-10%). Aspectul în imunofluorescenţa indirectă este de tip granular (pătat); de asemenea a fost descrisă o asociere cu alela HLA DQw1. Prevalenţa anticorpilor anti-Ku în afecţiunile autoimune este variabilă, originea etnică fiind un element important. Spre exemplu, în America de Nord şi Europa au fost descrise cazuri de SLE asociaţi cu anticorpi anti-Ku, dar nu şi în Japonia. Sindromul Sjögren primar, ca şi hipertensiunea pulmonară primitivă constituie alte condiţii clinice frecvent asociate cu anti-Ku1;2.
Anticorpii anti-PDGFR
PDGFR (platelet derived growth factor receptor) sunt receptori de suprafaţă tirozinkinazici pentru membrii familiei PDGF – factori care reglează proliferarea, diferenţierea, creşterea şi dezvoltarea celulară. PDGFR deţin un rol important în dezvoltarea embrionului şi contribuie la întreţinerea ţesutului conjunctiv la adult. Dereglarea semnalului PDGFR conduce la ateroscleroză, hipertensiune pulmonară şi fibroza organelor. Fibroza rezultă din depunerea excesivă a matricei extracelulare ca urmare a activarii fibroblaştilor (celule de natură mezenchimală). PDGF promovează expansiunea fibroblaştilor, astfel că în leziunile fibrotice se găsesc nivele crescute de PDGF. Anticorpii anti-PDGFR au fost descrişi la pacienţi cu scleroză sistemică2.
Anticorpii anti-Ro52 sunt îndreptaţi împotriva unei proteine de 52 kDa. Aceşti anticorpi sunt nespecifici; ei pot apărea atât în boli autoimune cât şi în boli infecţioase cu o prevalenţă de 5-81%1;2.
În tabelul de mai jos este menţionată sensibilitatea şi specificitatea diverselor tipuri de autoanticorpi pentru scleroza sistemică2:
|
Autoanticorpi anti- |
Sensibilitate (%) |
Specificitate (%) |
|
Scl-70 |
65.1 |
98.5 |
|
CENP-A |
10.9 |
98.5 |
|
CENP-B |
13.2 |
98.5 |
|
RP11 |
5.4 |
98.5 |
|
RP155 |
7.0 |
100 |
|
Fibrilarină |
1.6 |
100 |
|
NOR90 |
3.9 |
99 |
|
Th/To |
6.2 |
98 |
|
PM/Scl 100 |
6.6 |
99 |
|
PM/Scl 75 |
11.8 |
98 |
|
Ku |
5.7 |
99 |
|
PDGFR |
0.8 |
99.5 |
Recomandări – pacienţi cu suspiciune clinică de scleroză sistemică şi rezultat pozitiv la testul ANA -imunofluorescenţă indirectă1;2.
Pregătire pacient – à jeun (pe nemâncate) sau postprandial (după mese)2
Specimen recoltat – sânge venos2.
Recipient de recoltare – vacutainer fără anticoagulant cu/fără gel separator2.
Prelucrare necesară după recoltare – se separă serul prin centrifugare2.
Volum probă – minim 1 mL ser2.
Cauze de respingere a probei
- specimen hemolizat;
- specimen icteric, lipemic;
- specimen contaminat bacterian2.
Stabilitate probă – serul separat este stabil 14 zile la 2-8ºC şi timp îndelungat la -20ºC. Nu decongelaţi/recongelaţi2.
Metodă – imunoblot. Testul utilizează 13 antigene native şi recombinate purificate, care sunt fixate în cip-uri paralele pe membrana unui strip. Antigenele sunt reprezentate, în ordinea fixării pe strip, de:
– Scl-70: antigen nativ purificat
– CENP A: antigen recombinat
– CENP B: antigen recombinat
– RP 11: subunitate recombinată a ARN polimerazei III
– Rp 155: : subunitate recombinată a ARN polimerazei III
– Fibrilarină: antigen recombinat
– NOR 90: antigen recombinat
– Th/To: antigen recombinat
– Pm-Scl 100: antigen recombinat
– Pm-SCL 75: antigen recombinat
– Ku: antigen recombinat
– PDGFR: antigen recombinat
– Ro 52: antigen recombinat
Într-o primă etapă strip-ul încărcat cu antigenele purificate este incubat împreună cu serul diluat al pacientului. Dacă în ser sunt prezenţi anticorpi specifici aceştia se vor lega de antigenele corespunzătoare de pe strip. După o etapă de spălare, strip-ul este incubat cu un conjugat anti-IgG uman marcat cu fosfataza alcalină. Conjugatul se va ataşa la porţiunea IgG a complexului antigen-anticorp. După îndepărtarea prin spălare a conjugatului nelegat se adaugă soluţia de colorare (substratul enzimei) – un sistem de detecţie enzimatică colorimetrică . Dacă este prezent conjugatul legat reacţia enzimatică va genera un produs colorat albastru-închis la nivelul benzilor ocupate de anticorpi specifici. Astfel, benzile vizualizate la nivelul stripului sunt rezultatul legării anticorpilor specifici de antigenele individuale de la nivelul strip-ului.
Pe fiecare strip există o bandă de control intern. Apariţia unei reacţii de culoare intense la acest nivel certifică faptul că toate etapele testului imunoblot au fost executate corect2.
Valori de referinţă şi interpretarea rezultatelor
Interpretarea definitivă a rezultatelor testului se face cu ajutorul unui software (după scanarea strip-urilor) care în funcţie de intensitatea semnalului, acordă un punctaj pentru fiecare bandă a strip-ului, astfel:
|
EVALUARE SEMNAL |
INTENSITATE SEMNAL |
REZULTAT |
|
|
Fără bandă |
0-5 |
0 |
NEGATIV |
|
Bandă slabă |
6-10 |
(+) |
ECHIVOC |
|
Bandă medie-intensă |
11-25 sau 26-50 |
+,++ |
POZITIV |
|
Bandă foarte intensă |
>50 |
+++ |
INTENS POZITIV |
În final este calculată suma punctelor acordate şi se va genera rezultatul testului.
Un rezultat pozitiv confirmă prezenţa anticorpilor specifici .
Un rezultat echivoc indică faptul că prezenţa auto- anticorpilor este incertă; în funcţie de contextul clinic al pacientului testul va fi repetat la un interval de 1-2 luni.
Un rezultat negativ indică absenţa auto-anticorpilor specifici.
Valori de referinţă
Anti-Scl 70: negativ
Anti-CENP A: negativ
Anti-CENP B: negativ
Anti-RP 11: negativ
Anti-RP 155: negativ
Anti-fibrilarină: negativ
Anti-NOR 90: negativ
Anti-Th/To: negativ
Anti-Pm-Scl 100: negativ
Anti-Pm-Scl 75: negativ
Anti-Ku: negativ
Anti-PDGFR: negativ
Anti-Ro 52: negativ2.
Bibliografie
- Khanh T Ho, John D Reveille. The clinical relevance of autoantibodies in scleroderma. In Arthritis Res Ther. 2003; 5(2): 80–93.
- Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2012. Ref Type: Catalog
- Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide. Antiscleroderma – 70 Antibodies. www.labcorp.com 2012. Ref Type: Internet Communication.
- LeRoy E.C., Medsger T.A. Criteria for the classification of early systemic sclerosis. In J Rheumatol 2001; 28:1573-1576.
- Masumato H et al. Human Centromere Antigen (CENP-B) Interacts with a Short Specific Sequence in Alphoid DNA , a Human Centromeric Satellite. In J Cell Biol, 1989 November 1; 109(5): 1963–1973.