Cofactorul pentru ristocetina

Analize medicale

Laborator Synevo

 

Informatii generale

Factorul von Willebrand (FvW) este o glicoproteina de adeziune, cu multiple roluri in coagulare, care circula in plasma sub forma unui amestec heterogen de multimeri legati disulfidic. FvW este sintetizat in celulele endoteliale si megakariocite sub forma unei pre-pro-molecule, continand un peptid semnal de 22 aminoacizi, un propeptid de 741 aminoacizi si proteina matura de 2050 aminoacizi. FvW este neobisnuit de bogat in cisteina, implicata in formarea de legaturi disulfidice. Monomerii pro-FvW sunt asamblati la nivelul reticulului endoplasmic in dimeri prin legaturi disulfidice ale capetelor C-terminale, iar multimerizarea are loc in aparatul Golgi prin formarea de legaturi disulfidice ale capetelor N-terminale ale dimerilor adiacenti, proces ce pare a fi catalizat de o activitate disulfid-izomerazica localizata in propeptidul FvW4. Clivarea propeptidului are loc dupa asamblarea multimerilor, in special intracelular, dar poate avea loc si dupa secretie. Multimerii de FvW variaza in marime, de la dimerii de 600 000D la multimerii foarte mari de 20 milioane D. FvW este stocat  in α-granulele plachetare si in corpusculii Weibel-Palade din celulele endoteliale, acestea fiind formele cele mai mari si mai potente biologic. Rezervele endoteliale de FvW pot fi eliberate terapeutic prin administrarea de desmopresina.

Timpul de injumatatire al FvW plasmatic este de ~8-12 ore. Aproximativ 15% din FvW circulant este localizat in compartimentul plachetar, acesta fiind derivat in intregime din sinteza intramedulara, dar ambele pool-uri de FvW sunt necesare pentru hemostaza. Celulele endoteliale secreta multimeri mai mari decat cei care circula in plasma; acestia sunt degradati de catre o metaloproteaza specifica, ADAMTS13, rezultand in reducerea in marime a celor mai mari multimeri. Scaderea activitatii ADAMTS13, congenitala sau prin inhibitori dobanditi, joaca un rol central in patofiziologia purpurei trombotice trombocitopenice3;4.

FvW are situsuri de legare pentru FVIII, heparina, colagen, glicoproteinele plachetare GPIb si GPIIb-IIIa, detinand multiple functii in hemostaza. FvW stabilizeaza FVIII protejandu-l  fata de inactivarea de catre PC activata, prelungindu-i astfel timpul de injumatatire in circulatie si localizandu-l eficient la locul injuriei vasculare1;2;4. Fiecare monomer de FvW are un situs de legare pentru FVIII, totusi in vivo numai 1-2% din monomeri sunt ocupati de FVIII, astfel explicandu-se faptul ca prezenta multimerilor foarte mari nu este esentiala pentru functia de carrier a FVIII. In orice caz, o modificare in nivelul plasmatic al FvW se asociaza cu modificari concordante ale concentratiei plasmatice de FVIII2.

FvW este o proteina structurala si parte a matricei subendoteliale. De asemenea joaca un rol important in atasarea plachetelor la suprafetele subendoteliale, in mod particular la forte de forfecare moderate-mari (functie explorata partial in vivo prin masurarea timpului de sangerare), actioneaza ca punte intre plachete si promoveaza agregarea plachetara. Initial are loc ancorarea plachetelor la locul injuriei vasculare prin interactiunea FvW cu GPIb, urmata de activarea plachetara si expunerea GPIIb-IIIa, care leaga fibrinogenul, FvW si alti liganzi1;4. Ambele activitati de legare ale FvW sunt maxime la multimerii cu greutate moleculara mare. Interactiunea dintre GPIb si FvW poate fi explorata in vitro prin adaugarea antibioticului ristocetina2.

Nomenclatura recomandata  de Societatea Internationala de Hemostaza si Tromboza pentru complexul FVIII-FvW este2:

FVIII

 

FvW

 

Proteina

VIII

Proteina matura

FvW

Antigen

VIII:Ag

Antigen

FvW:Ag

Functie

VIII:C

Activitatea de cofactor al ristocetinei

FvW:RCo

 

 

Activitatea de legare a colagenului

FvW:CB

 

 

Capacitatea de legare a FVIII

FvW:FVIIIB

 Anomaliile functiei FvW determina boala von Willebrand (vWD), cea mai frecventa boala hemoragica mostenita, cu o prevalenta de aproximativ 1% in populatia generala, insa cu o prevalenta a bolii semnificative clinic de 1:10004. Afectiunea este caracterizata prin hemoragii cutaneo-mucoase, transmitere autosomal dominanta si prelungirea timpului de sangerare. Boala nu este omogena, pe de o parte datorita functiilor fiziologice multiple jucate de FvW, iar pe de alta parte prin demonstrarea de modele genetice diferite. Aproximativ 60% din variatiile nivelului FvW plasmatic sunt atribuite unor factori genetici. Astfel, indivizii cu grup sanguin 0 au niveluri de FvW in medie cu 30% mai mici decat cei cu celelalte grupe sanguine. In plus, nivelul de FvW este sub control hormonal; de asemenea este influentat si de alti factori care complica expresia bolii. Variatii de pana la 20% au fost raportate cu ciclul menstrual, nivelurile cele mai scazute fiind inregistrate in faza foliculara precoce. De asemenea nivelul creste cu ~15% la fiecare decada de inaintare in varsta3. Clasificarea actuala a vWD identifica doua categorii majore2;3;4:

  • Deficiente cantitativeale FvW:
  • Tipul 1, varianta cea mai comuna (70-80% din cazurile simptomatice de vWD), caracterizata prin deficienta partiala a FvW, insotita de reducerea concordanta a activitatii FVIII si activitatii de cofactor la ristocetina, in general intre 20 si 50% din normal, in asociere cu o structura normala a multimerilor.
  • Tipul 3se asociaza cu deficiente severe si nivele foarte scazute sau nedetectabile de FvW. Este o forma rara, cu transmitere autosomal recesiva si caracterizata prin diateza hemoragica severa.
  • Anomalii calitativeale FvW (tipul 2, reprezentand 20-30% din cazuri), cu 4 subtipuri reflectand mecanisme patofiziologice diferite:
  • Tipul 2Ase caracterizeaza  prin absenta multimerilor de greutate moleculara mare si intermediara din plasma, rezultand in alterarea interactiunii FvW cu plachetele si se asociaza cu nivele ale activitatii cofactorului la ristocetina disproportionat de scazute comparativ cu antigenul FvW.
  • Tipul 2B se caracterizeaza prin afinitate crescuta a FvW pentru GPIb plachetara, sangerarea la acesti pacienti rezultand paradoxal ca urmare a clearance-ului multimerilor cu greutate moleculara mare si plachetelor din circulatie, asociind trombocitopenie.
  • In tipul 2Minteractiunea FvW cu GPIb este deficitara rezultand din defecte ale domeniului FvW care leaga GPIb, cu scaderea functiei plachetar-dependente, in prezenta de multimeri normali la electroforeza pe gel.
  • In tipul 2N (Normandy) afinitatea scazuta a FvW pentru FVIII determina niveluri plasmatice scazute ale FVIII. Acest tip este suspectat in prezenta unei reduceri marcate a nivelului FVIII in comparatie cu FvW (pseudohemofilia).

Au fost raportate si alte subtipuri, incluzand tipul plachetar (pseudo-vWD) care rezulta din mutatii la nivelul GPIb plachetare. De asemenea exista forme dobandite foarte rare de vWD asociate cu prezenta de autoanticorpi, in asociere cu boli autoimune, proliferari clonale, hipotiroidism4;6;7.

vWD se manifesta ca un defect hemostatic multifatetat, deficienta FVIII si hemostaza primara anormala contribuind la tendinta hemoragica si conducand la anomalii de laborator caracteristice si distincte3. Expresia  clinica este in general usoara in tipul 1, cu cresterea severitatii in tipul 2 si tipul 3. Multi din pacientii cu tipul 1 de vWD pot fi asimptomatici. In general severitatea sangerarii se coreleaza cu gradul reducerii activitatii FVIII, dar nu cu gradul prelungirii timpului de sangerare sau cu tipul grupului sanguin2. In formele usoare de vWD tabloul clinic este dominat de sangerarile cutaneo-mucoase (epistaxis, echimoze, sangerari gingivale, menometroragii), iar in formele cele mai severe, in care FVIII este scazut, pot aparea hemartroze si hematoame intramusculare, hemoragiile posttraumatice si postchirurgicale, in primul rand dupa extractii dentare, constituind riscul principal, ca si in hemofilia usoara3. vWD poate fi inalt prevalenta la pacientele cu menoragie izolata2. In tipul 1 simptomele pot scadea in severitate in timpul sarcinii, terapiei estrogenice sau cu inaintarea in varsta. Pe de alta parte, riscul de sangerare la femeile cu vWD este mare postpartum cand nivelul de FvW scade brusc de la nivelele crescute dezvoltate in timpul sarcinii3.

Recomandari pentru efectuarea testelor – diagnosticul deficitului/anormalitatii FvW, subtiparea vWD si diferentierea de hemofilia A (impreuna cu determinarea activitatii FVIII); monitorizarea eficacitatii terapeutice a tratamentului cu desmopresina sau concentrat de FvW (FvW:RCo) 7.

Pregatire pacient – à jeun (pe nemancate)5. Se va evita tratamentul cu anticoagulante orale cu 2 saptamani inainte, iar cu heparina cu doua zile inaintea testarii ; nu se va recolta de pe un cateter heparinizat6. Testele trebuie efectuate la distanta de transfuzii, tratament substitutiv cu FvW, administrarea de desmopresina7.

Specimen recoltat – sange venos5.

Recipient de recoltare – vacutainer cu citrat de Na 0.105M (raport citrat de sodiu – sange=1/9). Presiunea realizata de garou trebuie sa fie intre valoarea presiunii sistolice si cea a presiunii diastolice si nu trebuie sa depaseasca 1 minut. Daca punctia venoasa a esuat, o noua tentativa pe aceeasi vena nu se poate face decat dupa 10 minute5.

Cantitate recoltata – se vor recolta 2 vacutainere cat permite vacuumul; pentru a preveni coagularea partiala a probei se va asigura amestecul corect al sangelui cu anticoagulantul, prin miscari de inversiune a tubului5.

Prelucrare necesara dupa recoltare – proba va fi centrifugata 15 minute la 2500g, urmata imediat de separarea plasmei si congelarea acesteia; probele recoltate in afara laboratorului vor fi transportate in recipientul destinat probelor congelate5.

Cauze de respingere a probei – vacutainer care nu este plin; proba de singe hemolizata sau coagulata; plasma care nu a ajuns congelata la laborator5.

Stabilitate proba  plasma separata este stabila 4 saptamani la  – 20ºC5. 

Metoda 

FvW:Ag – imunoturbidimetrica: masoara nivelul de FvW independent de compozitia multimerilor plasmatici (particule de latex invelite in anticorpi policlonali specifici anti-FvW aglutineaza in prezenta antigenului FvW, determinand cresterea densitatii optice, direct proportional cu concentratia FvW din plasma testata)5.

FvW:RCo – plasma pacientului este mixata cu plachete fixate in formol, in prezenta ristocetinei, iar extensia agregarii plachetare este detectata foto-optic si este proportionala cu activitatea FvW din plasma6.

Valori de referinta5

 

FvW:Ag  

FvW:RCo

Persoane cu grup sanguin 0        

42-141%

40-125%

Persoane cu grup sanguin A, B, AB

66-176%.

49-163%

 Interpretarea rezultatelor

vWD trebuie luata in considerare pentru diagnosticul diferential al oricarui pacient cu istoric personal si familial de sangerare si care are PT si aPTT normale. aPTT poate fi prelungit in formele severe de vWD cu nivele scazute de FVIII6. De asemenea numarul de trombocite este in general normal, insa la pacientii cu tipul 2B poate sa apara trombocitopenia. Timpul de sangerare este de obicei prelungit, dar poate fi normal in forme usoare de vWD.

In tabel sunt prezentate modificarile celor doua teste specifice pentru FvW impreuna cu activitatea FVIII in diferitele tipuri de vWD2;6;7

 

FvW:Ag

FvW:RCo

FVIII:C (activitatea FVIII)

Tipul 1

scazut

concordant scazut

scazut

Tipul 2A

normal sau usor scazut

discordant scazut

normal sau scazut

Tipul 2B

normal sau usor scazut

discordant scazut

normal sau scazut

Tipul 2M

normal sau usor scazut

discordant scazut

normal sau scazut

Tipul 2N

normal

normal

semnificativ scazut (5-30% din normal)

Tipul 3

foarte scazut (<5-10%) 

sau absent

foarte scazut (<5-10%)

sau nedetectabil

semnificativ scazut (5-30% din normal)

vWD dobandita

normal sau scazut

scazut

normal sau scazut

In tipul 1 de vWD severitatea clinica se coreleaza cu FvW:RCo. Un nivel foarte scazut al FvW:Ag sugereaza tipul 3 de boala.

FvW:Ag, FvW:RCo si activitatea FVIII trebuie masurate pe aceeasi proba, un raport FvW:Ag : FvW:RCo <0.7 sugerand tipul 2, iar un raport FVIII:C : FvW:Ag <0.7 sugerand tipul 2N de vWD.

In hemofilie nivelul de FvW este normal2

Limite si intreferente

FvW este un reactant de faza acuta, iar la pacientii cu deficit congenital nivelul sau poate creste pana la valori normale intr-o serie de conditii clinice tranzitorii, cum ar fi: stres, inflamatie, infectii acute, efort fizic, postchirurgical, trimestrele II si III de sarcina, precum si in administrarea de estrogeni3;4;6. De aceea, este preferabila evaluarea pacientului la distanta de aceste situatii. Pe de alta parte, este improbabil ca sarcina sau o reactie de faza acuta sa mascheze deficitele cantitative severe sau pe cele calitative.

Acidul valproic, hipotiroidismul si bolile cardiace valvulare pot scadea FvW3.

Obtinerea de nivele la limita inferioara a normalului atat pentru FvW:Ag cat si pentru FvW:RCo nu exclude diagnosticul de vWD (tipul 1), fiind necesara repetarea testarii7.

Aceste teste nu diferentiaza intre tipurile 2A versus 2B, respectiv 2M, sau tipul plachetar (pseudo-vWD), fiind necesare testarea agregarii plachetare induse de ristocetina si/sau analiza multimerilor FvW5. De asemenea teste genetice pot fi necesare pentru diferentierea unor tipuri 2B de tipul 2A.

Testul care determina activitatea cofactorului ristocetinei este diferit de cel care masoara agregarea plachetara indusa de ristocetina, care utilizeaza trombocitele si plasma proaspata ale pacientului si care este util in special pentru tipul 2B si tipul plachetar (pseudo-vWD) 3.

Prezenta factorului reumatoid, anticorpilor anti-albumina bovina sau anti-iepure pot duce la supraestimarea nivelului FvW:Ag.

Plasma tulbure poate duce la subestimarea nivelului de FvW:Ag5.

Bibliografie

  1. Brummel-Ziedins K, Orfeo T, et al. “Blood Coagulation and Fibrinolysis”. In Wintrobe`s Clinical Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 553-4.
  2. Castaman G, Tosseto A, Rodeghiero F. „von Willebrand Disease”. In Practical Hemostasis and Thrombosis, O’Shaughnessy D, Makris M, Lillicrap D eds, Blackwell Publishing, 2008, 51-56.
  3. Friedman K, Rodgers G. „Inherited Coagulation Disorders”. In Wintrobe`s Clinical Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 1386-92.
  4. Johnsen J, Ginsburg D. „von Willebrand Disease”. In Williams Hematology, Lichtman M, Beutler E, Kipps T, Seligsohn U, Kaushansky K, Prchal J., 7th ed, McGraw-Hill Medical, 2006, 1929-37.
  5. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate, 2010. Ref Type: Catalog.
  6. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. von Willebrand Profile. www.labcorp.com. 2010. Ref Type: Internet Communication.
  7. Mayo Clinic, Mayo Medical Laboratories. Reference Laboratory Services for Health Care Organizations. von Willebrand Disease, von Willebrand Factor Antigen, Ristocetin Cofactor, Plasma. www.mayomedicallaboratories.com. 2010. Ref Type: Internet Communication.

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată. Câmpurile obligatorii sunt marcate cu *