Mutatia BRAF V600E in tumori

Laboratorul Synevo

 

Informatii generale

Proto-oncogena BRAF (v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1) cu locusul 7q34 este alcatuita din 18 exoni si codifica o serin/treonin protein-kinaza de 84.4 kDa, din familia kinazelor Raf implicata in calea de semnalizare intracelulara Ras/Raf/MEK/ERK (MAPK/ERK), ce transmite semnale de la receptori celulari (de exemplu, EGFR – epidermal growth factor receptor = receptorul pentru factorul de crestere epidermica) la nucleu, cu rol in diferentierea, proliferarea, senescenta si supravietuirea celulara. Aceasta cale de transductie a semnalului este activata constitutiv in numeroase tipuri de tumori maligne umane de obicei ca urmare a unor mutatii ale oncogenelor KRAS si BRAF^1;2;3.

Mutatiile genei BRAF pot fi de doua tipuri:

• mostenite (ale liniei germinale) – asociate cu sindromul cardiofaciocutanat – conditie genetica rara caracterizata prin defecte cardiace, retard mental si un aspect facial distinctiv;
• dobandite (somatice) – asociate cu forme diferite de cancer (limfom non-Hodgkin, cancer colorectal, melanom malign, cancer tiroidian papilar, cancer pulmonar altul decat cel cu celule mici –NSCLC, cancer ovarian)^4;5. Aproximativ 7% dintre tumorile maligne umane contin mutatii BRAF⁶.

Pana in prezent au fost identificate peste 50 mutatii distincte ale genei BRAF multe dintre acestea fiind responsabile de cresterea activitatii BRAF de 1.5 pana la 700 ori, in functie de tipul mutatiei. Dintre mutatiile BRAF activatoare asociate cu tumori cea mai frecventa (responsabila de peste 80% din cazuri) este V600E care are la baza o tranzitie T-A la nivelul nucleotidei 1799 din exonul 15, ce induce o substitutie a valinei cu acidul glutamic in codonul 600 din segmentul activator. Consecinta acestei mutatii punctiforme missens este ca situsul de activare al protein-kinazei devine expus (in mod normal fiind ascuns intr-o punga hidrofoba), ceea ce conduce la o activare constitutiva BRAF. Astfel, celulele maligne care prezinta mutatia V600E prolifereaza intr-un mod independent de factorul de crestere². Mutatia predispune de asemenea la inhibarea apoptozei, cresterea invazivitatii tumorii si reprezinta un eveniment timpuriu in cursul carcinogenezei⁶.

Aceasta mutatie a fost identificata in urmatoarele tipuri de tumori:

1. Cancerul tiroidian papilar

Mutatia V600E constituie cea mai frecventa modificare genetica in cancerul tiroidian papilar (~40-50% din cazuri). In urma unui studiu care a urmarit pe o perioada de 15 ani evolutia unui grup de pacienti cu aceasta forma de cancer s-a constatat ca mutatia V600E reprezinta un factor de prognostic nefavorabil independent de celelalte caracteristici clinico-patologice⁷.

1. Melanomul malign

Mutatia este prezenta in aproximativ 50% din cazurile de melanom malign. Studii recente au aratat ca V600E este asociata formei de boala cu risc inalt (debut precoce, afectarea primara a trunchiului, lipsa unei afectari cutanate cronice, supravietuire redusa) si de aici importanta inhibarii teraputice a proteinei Braf mutante. In 2011 FDA a aprobat medicamentul vemurafenib – inhibitor oral selectiv al activitatii kinazice a Braf ce contine mutatia V600E – ca tratment in melanomul malign metastatic. Vemurafenib nu este aprobat in cazul pacientilor cu gena BRAF de tip salbatic⁸.

1. Cancerul pulmonar altul decat cel cu celule mici (NSCLC)

In NSCLC se raporteaza o frecventa a mutatiei de 1-4%. In aceasta forma de cancer mutatia BRAF V600E este prezenta mai frecvent la femei, fiind asociata cu o forma histologica agresiva si cu un prognostic rezervat⁹.

1. Cancerul ovarian

Intr-un studiu recent publicat s-a constatat ca mutatia V600E este asociata cu tumori ovariene in stadiu initial, histologie de tip borderline seros (cu potential malign redus) si cu prognostic favorabil. Observatiile pot influenta abordarea terapeutica a pacientelor cu aceasta forma de tumori ovariene¹⁰.

  

1. Leucemia cu celule paroase (Hairy-cell Leukemia, HCL)

Mutatia somatica V600E a fost recent descrisa ca un marker molecular pentru HCL. Deoarece prezenta sa a fost constatata la majoritatea pacientilor se considera ca mutatia detine un rol esential in patogenia bolii. De asemenea formele refractare ar putea beneficia de tratamentul cu inhibitori BRAF¹¹.

1. Cancerul colo-rectal (CRC)

Calea de semnalizare intracelulara MAPK/ERK este perturbata frecvent in cancerul colo-rectal, supraexpresia EGFR fiind raportata in aproximativ 50% din cazuri, iar mutatii activatoare ale genelor KRAS si BRAF in 30-50% si, respectiv, 10% din cazuri³ (vezi fig.1)

Celulele epiteliale normale din colon, in evolutia lor spre malignitate, pot urma mai multe cai:

• secventa traditionala adenom-carcinom asociata cu instabilitate cromozomiala si caracterizata prin acumularea treptata de mutatii ale unor gene specifice – APC, KRAS si TP53 – ce induc modificari displazice progresive ale epiteliului colonic;
• o cale asociata cu instabilitatea microsatelitilor (MSI), mutatii BRAF si metilarea extensiva a ADN-ului;
• o cale de “fuziune” asociata cu metilarea enzimei O-6 metilguanin-ADN-metiltransferaza (MGMT), mutatia KRAS si inactivarea genei care codifica proteina tumorala p53 (TP53).

Desi mutatiile BRAF au fost observate in principal in CRC sporadic cu MSI, acestea au fost detectate intr-un procent mic si in formele de cancer cu stabilitate a microsatelititilor (MSS). In particular, mutatiile BRAF au fost gasite mai frecvent in polipii colonici premaligni si in CRC timpuriu. Deoarece prezenta concomitenta a mutatiilor KRAS si BRAF este rar intalnita in polipii colonici premaligni si in stadiile timpurii de CRC, acestea sunt considerate mutatii alternative sau mutatii ce se exclud reciproc¹².

Atat mutatiile KRAS cat si cele BRAF nu sunt decat in mod exceptional prezente in CCR asociat cu sindromul Lynch (sindromul cancerului colorectal nonpolipozic ereditar – HNPCC). Aceasta afectiune este cauzata de mutatii ale liniei germinale ce afecteaza genele care intervin in repararea erorilor aparute la nivelul materialului genetic in timpul procesului de replicare – MMR (MMR – “mismatch repair genes”) reprezentate de MLH1, MSH2, MSH6, PMS2. Alterarea functiei acestor gene este strans asociata cu fenomenul MSI, respectiv insertia sau deletia unor scurte unitati repetitive (tip CA) din constitutia microsatelitilor (segmente de ADN alcatuite din secvente care cuprind 1-5 perechi de nucleotide, repetate in tandem si localizate in regiunile codificatoare sau necodificatoare ale unor gene). Din acest motiv, testarea tesuturilor tumorale pentru prezenta MSI impreuna cu demonstrarea pierderii expresiei proteinelor MMR prin imunohistochimie este utila pentru stabilirea diagnosticului de sindrom Lynch. Totusi trebuie avut in vedere faptul ca fenotipul tumoral asociat cu MSI nu este limitat la cancerele ereditare, fiind intalnit si in aproximativ 20% din cazurile de CRC sporadic. Astfel, testarea MSI nu poate distinge intre o mutatie somatica (sporadica) si o mutatiei a liniei germinale (mostenita) si nici nu poate identifica gena afectata. De asemnea nici testarea imunohistochimica nu poate face aceasta distinctie, desi identifica gena responsabila.

Cel mai adesea prezenta unor defecte MMR in CRC sporadic se datoreaza unor anomalii la nivelul genei MLH1, iar cea mai frecventa cauza de inactivare a genei este hipermetilarea promotorului (fenomen epigenetic). Mai mult, in aproximativ 70% din tumorile care prezinta hipermetilarea promotorului MLH1 a fost identificata mutatia BRAF V600E. Este important faptul ca mutatia V600E nu a fost identificata pana in prezent in tumori asociate cu mutatii MLH1 ale liniei germinale. Astfel, testarea mutatiei BRAF V600E poate diferentia o mutatie a liniei germinale de o inactivare somatica/epigenetica MLH1¹³.

Testarea mutatiei V600E in CRC prezinta si implicatii terapeutice. Deoarece Braf kinaza este situata in aval de EGFR si KRAS in cascada MAPK, tumorile ce contin mutatia V600E cu activare persistenta a acestei cai de transductie a semnalului sunt rezistente la orice tip de terapie anti-EGFR. Prin urmare, inainte de administrarea tratamentului cu inhibitori de tirozinkinaza EGFR este necesara testarea prezentei mutatiei V600E a genei BRAF pentru identificarea corecta a pacientilor care pot beneficia de terapie³.

Recomandari pentru testarea mutatiei BRAF V600E

• in CRC metastatic pentru selectarea pacientilor la care este oportuna administrarea unui inhibitor EGFR (marker molecular cu valoare predictiva privind raspunsul la tratamentul anti-EGFR);
• screening-ul sindromului Linch in cazul tumorilor cu MSI ce demonstreaza imunohistochimic pierderea expresiei proteinei MLH1;
• in melanomul malign pentru a anticipa raspunsul clinic la inhibitori BRAF (de exemplu vemurafenib) sau MEK;
• in carcinomul tiroidian papilar pentru evaluarea prognosticului^6;14.

Specimen recoltat – sectiuni nefixate, necolorate din tesut conservat in parafina (4-5 lame); cu ajutorul unui marker carioca vor fi evidentiate zonele in care este prezent tesutul tumoral¹⁵.

Metoda – secventierea exonului 15 al genei BRAF¹⁵.

Raportarea si interpretarea rezultatelor

Va fi comunicata prezenta sau absenta mutatiei BRAF V600E in ADN-ul extras din tesutul tumoral¹⁵.

Interpretarea rezultatului obtinut este in functie de tipul tesutului tumoral:

• In cancerul papilar tiroidian mutatia BRAF V600E reprezinta un nou indicator de progresie si agresivitate a bolii.
• Pacientii cu melanom malign care prezinta mutatia V600E pot beneficia de tratmentul cu vemurafenib.
• Tumorile colonice care prezinta alaturi de hipermetilarea promotorului MLH1 si mutatia BRAF V600E sunt cu mare probabilitate sporadice.
• Prezenta mutatiei V600E in gena BRAF se asociaza cu un prognostic nefavorabil si cu absenta rapunsului la tratamentul cu anti-EGFR a pacientilor cu tumori metastatice de colon^6;13;14.

Limite si interferente

Mutatia BRAF V600E poate fi detectata numai daca in proba se gaseste un procent de celule tumorale de minimum 25%^14;15.

Testarea mutatiei in tumora primara vs. leziunile metastatice poate da uneori rezultate discordante.

Nu toti pacientii cu melanom malign avand mutatia V600E vor raspunde la tratamentul anti-BRAF.

Nu toti pacientii cu CCR metastic si gena BRAF de tip salbatic vor benficia de terapia anti-EGFR¹³  

Bibliografie

1. BRAF (v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1). In Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology. http://atlasgeneticsoncology.org. Reference Type: Internet Communication.
2. Safaee Ardekani G, Jafarnejad SN, Tan L, Saeedi A, Li G. The Prognostic Value of BRAF Mutation in Colorectal Cancer and Melanoma: A Systematic Review and Meta-Analysis. In PloS 2012;7(10):e47054.
3. Tie J, Desai J. BRAFV600E as a Therapeutic Target in Colorectal Cancer. In European Oncology, 2010:6(1):60-4.
4. BRAF (v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1). www.ncbi.nlm.nih.gov. Reference Type: Internet Communication.
5. Sarcozy A, Carta C et al. Germline BRAF mutations in Noonan, LEOPARD and cardiofaciocutaneous Syndrome: moleculatr diversity and associted phenotypic spectrum. In Hum. Mutat. 2009 Apr; 30(4):695-702.
6. BRAF V600E Mutation Detection. Henry Ford Health System. Pathology and Laboratory Medicine. www.henryford.com. Reference Type: Internet Communication.
7. Elisei R, Ugolini C et al. BRAFV600E Mutation and Outcome of Patients with Papillary Thyroid Carcinoma: A 15-Year Median Follow-Up Study. In J. Clin. Endocrinol. Metab. 2008 Oct;93(10):3943-9.

8. Vora N, Buehler B et al. Melanoma and BRAF. Medscape Reference. http://emedicine.medscape.com. 2011.
9. Marchetti A, Felicioni L, et al. Clinical features and Outcome of patients with Non-Small-Cell Lung Cancer Harboring BRAF Mutations. In JCO Sept. 2011, vol.29, no.26, 3574-3579.
10. Grisham RN, Iyer G, et al. BRAF mutation is associated with early stage disease and improved outcome in patients with low-grade serous ovarian cancer.
11. Dietrich S, Glimm H. BRAF Inhibition in Refractory Hairy-Cell Leukemia. In N Engl J Med 2012; 366:2038-2040.
12. Monticone M, Biollo E et al. Gene expression deregulation by KRAS G12D and G12V in a BRAF V600E context. In Mol Cancer, 2008;7: 92.
13. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. BRAF Mutation (V600E) Analysis. www.mayomedicallaboratories.com. Reference Type: Internet Communication, 2013.
14. Cleveland Clinic Laboratories. BRAF V600E Mutation Analysis. Reference Type : Internet Communication, 2013.
15. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2013. Ref Type: Catalog.