HIV-1 ARN (cantitativ)

Laborator Synevo

 

Informatii generale 

Virusul imunodeficientei umane (HIV), agentul etiologic al sindromului imunodeficientei umane dobandite (SIDA), face parte din familia Retroviridae, subfamilia Lentivirinae.

Exista doua tipuri de HIV, fiecare cu mai multe subtipuri, diferentiate pe zone geografice:

HIV-1

• mai virulent;
• responsabil de epidemia globala actuala;
• severitatea infectiei variaza de la o persoana la alta;
• include grupul M cu 10 subtipuri, de la A la J, grupul O (secundar, “outlier”) si grupul N (non-M, non-O).

HIV-2

• descoperit initial in vestul Africii, este prezent la ora actuala si in unele tari din Europa si sud-estul

   Asiei;

• tip viral mai atenuat;
• genomul sau este mai inrudit cu genomul SIV (virusul imunodeficientei simiene) decat in cazul HIV-1;
• este divizat in 5 grupuri, de la A la E.

HIV este un virus ARN monocatenar cu polaritate pozitiva, cu o anvelopa pe care sunt prezente numeroase copii ale glicoproteinei de suprafata gp120 care se leaga de receptorul CD4 situat pe limfocitele T helper, macrofage, celule foliculare dendritice. Genomul contine doua filamente de ARN viral monocatenar pe care sunt dispuse urmatoarele 3 categorii de gene:

-gene structurale  

• gag (genome-associated gene) care codifica proteinele ce formeaza miezul sau  

          nucleul virusului: – p17 (proteina matricei);

                                             – p24 (proteina capsidala);

                                             – p7 (proteina nucleocapsidei);

• pol (polymerase) care codifica: – p11 (proteaza);

                                               – p66 (reverstranscriptaza);

                                              – p32 (integraza);

• env (envelope) care codifica proteinele ce formeaza anvelopa virionului:

                               -gp 160 – glicoproteina precursor care prin scindare da nastere la:

                                – gp 120 (de suprafata);

                                – gp 41 (transmembranara);

 -gene reglatoare: rev, nef, tat.;

– gene de maturare care sunt esentiale pentru patogenicitate in vivo: vif, vpu, vpr/vpx^1;5.

Patrunderea HIV in organism se face la nivelul:

-mucoaselor urogenitale, rectale sau orale, prin contact hetero- sau homosexual;

-perinatal, de la mama la fat;

-parenteral, prin solutii de continuitate ale tegumentelor si mucoaselor, injectii, tatuaje, transfuzii si transplant de organe de la donatori infectati^1;5.

Modelul comun este infectia prin mucoase, tintele initiale fiind celulele Langerhans din lamina propria subiacenta acestora. Sunt infectate mai ales macrofagele in curs de diferentiere cu susceptibilitate crescuta la replicare si limfocitele T activate. Infectia limfocitelor T CD4+ favorizeaza progresia spre ganglionii teritoriali si tesuturile mai profunde.

O etapa caracteristica pentru ciclul replicativ al retrovirusurilor este conversia ARN-ului viral in ADN proviral bicatenar prin reverstranscriere catalizata de reverstranscriptaza; ADN-ul proviral este translocat in nucleul celulei gazda, transformat in ADN circular si inserat in genomul acesteia cu ajutorul integrazei.  Dupa ce are loc integrarea, replicarea si sinteza de noi particule virale sunt dependente de prezenta unor factori celulari si virali necesari activarii promotorilor virali. Factorii externi cum ar fi coinfectia cu alti agenti patogeni, productia de citokine inflamatorii si activarea celulara potenteaza replicarea virala. Mecanismele moleculare care regleaza productia virala includ cai celulare in care sunt implicati factori, cum ar fi familia factorului nuclear – κB (NF- κB) (factori de transcriptie), care genereaza o cascada de evenimente ce conduc in final la expresia genomului viral.

Diseminarea virusului de la situsul de intrare se face pe cale sanguina, fie sub forma de virioni liberi, fie asociat cu limfocitele CD4+ sau monocitele⁵.

Aproximativ jumatate dintre pacientii infectati acut cu HIV prezinta un sindrom pasager asemanator mononucleozei infectioase; in faza acuta nivelurile de HIV-ARN sunt crescute in timp ce anticorpii specifici pot fi inca nedetectabili. Din acest motiv, detectarea prin reactia de polimerizare in lant (PCR) a acizilor nucleici HIV-1 s-a dovedit a fi mai sensibila decat testele ELISA de generatia a 3-a in perioada de „fereastra imunologica” (in primele 3-4 saptamani de la contactul infectant). Folosirea testelor de generatia a 4-a care combina detectia anticorpilor HIV cu cea a antigenului p24 conduce la o sensibilitate clinica mai mare in faza precoce de seroconversie; totusi detectarea HIV1-ARN este posibila cu 6 zile mai devreme in comparatie cu cea a antigenului p24. In tarile dezvoltate bancile de sange utilizeaza de rutina tehnici moleculare pentru depistarea donatorilor cu infectie HIV in stadiu initial^7;8.

Faza acuta este urmata de o perioada de infectie asimptomatica; in medie, intervalul de timp necesar pentru reducerea marcata a numarului de limfocite CD4+ si dezvoltarea sindromului imunodeficientei dobandite (SIDA) este de 10-11 ani; 5-10% dintre pacienti trec in aceasta faza mult mai rapid, in decurs de 3 ani, in timp ce 5-10% mentin un numar constant de celule CD4+ si raman asimptomatici o perioada de timp indefinita. Etapa SIDA este marcata de evolutia unor infectii cu risc vital, de neoplasme oportuniste sau de manifestari directe ale citopatogenicitatii HIV⁸.

Diagnosticul serologic al infectiei HIV in perioada prenatala este complicat de persistenta prelungita a anticorpilor materni (aproximativ 18 luni de la nastere). Din acest motiv, metoda de electie pentru depistarea infectiei neonatale sunt testele moleculare. Acestea se recomanda a fi efectuate dupa 2-3 saptamani de la nastere, la varsta de 1-2 luni si la 4-6 luni, pentru toti copiii nascuti din mame HIV pozitive^3;7.

Sunt descrise doua tipuri de teste care detecteaza incarcatura virala:

-un test care detecteaza incarcatura virala celulara, respectiv ADN proviral in celulele mononucleare din sangele periferic prin tehnica PCR;

-un test care detecteaza incarcatura de ARN plasmatic prin tehnica RT-PCR care foloseste reverstranscriptaza.

Ambele tehnici optimizate evalueaza cantitativ numarul de copii genomice⁷.

Testul de detectie a ADN-ului proviral este utilizat pentru diagnosticul infectiei la copiii nascuti din mame HIV pozitive, depistarea precoce a infectiei in perioada in care testele serologice, antigenul p24 si HIV-ARN sunt negative, precum si in cazul obtinerii unui rezultat echivoc la testul Western blot⁶. Testul de detectie a ARN-ului plasmatic poate fi utilizat de asemenea in diagnosticul infectiei perinatale (are aceeasi sensibilitate ca testul ADN proviral)³, insa principala sa utilitate este monitorizarea evolutiei bolii si a terapiei antiretrovirale⁶.

Monitorizarea viremiei este necesara pentru a evalua raspunsul la tratament si durabilitatea supresiei virusologice.  Tinta terapiei antiretrovirale, atat la pacienti „naivi” cat si la cei cu tratamente anterioare, este supresia HIV-ARN pana la nivele nedetectabile. Viremia trebuie determinata inaintea initierii terapiei, dupa 2-8 saptamani si apoi la intervale de 4-8 saptamani pana in momentul in care HIV-ARN devine nedetectabil. La 4 saptamani de la inceperea tratamentului trebuie sa se obtina o scadere a viremiei cu cel putin 1 log₁₀, iar dupa 16-24 saptamani este necesar sa se ajunga la valori nedetectabile. Viremiile tranzitorii, acele cresteri de ordinul a 50-1000 copii/mL, produse la pacienti cu valori anterioare suprimate, sunt ocazional intalnite dar nu par sa fie asociate cu un esec al raspunsului virusologic si nu necesita modificarea tratamentului. Un esec real al raspunsului virusologic este definit prin persistenta unei viremii detectabile la un pacient care a prezentat anterior o suprimare a viremiei sau prin incapacitatea de a obtine o viremie nedetectabila dupa 24-48 saptamani de tratament. Desi pot exista cauze multiple pentru acest esec virusologic trebuie suspectata in primul rand o rezistenta la tratamentul antiretroviral.

In clinicile unde monitorizarea viremiei nu este disponibila, folosirea numai a criteriilor clinice si eventual a numararii celulelor CD4 pozitive poate avea drept consecinta lipsa identificarii unei rezistente la antivirale si continuarea unui tratament numai partial eficient².

Recomandari pentru determinarea HIV-1  ARN  

• diagnosticul infectiei la nou-nascuti din mame seropozitive (cateva studii au demonstrat o sensibilitate de 25-40% a testului in primele saptamani de viata, care creste la 90-100% pana la varsta de 2-3 luni)³;
• monitorizarea evolutiei bolii (in prezenta sau in absenta terapiei antiretrovirale);
• evaluarea eficacitatii diferitelor tratamente antivirale: inaintea initierii terapiei (valori bazale), monitorizare indirecta pentru detectarea unei posibile rezistente antiretrovirale, lipsa compliantei la tratament⁶.

Avantajele testului

-sensibilitate si specificitate comparabile cu izolarea virusului; 

-utilizarea unor cantitati mici de probe de testat; 

-testul este rapid si se observa un paralelism cert intre incarcatura virala plasmatica sau celulara, depletia de celule T CD4 si progresia bolii, elemente ce trebuie luate in considerare la aplicarea tratamentului⁷. 

Pregatire pacient – nu este necesara⁴.

Specimen recoltat – sange venos⁴.

Recipient de recoltare – vacutainer ce contine EDTA ca anticoagulant⁴;

Cantitate recoltata – cat permite vacuumul⁴;

Prelucrare necesara dupa recoltare – proba nu va fi centrifugata⁴.

Cauze de respingere a probei – probe vechi, coagulate, hemolizate; folosirea heparinei ca anticoagulant⁴.

Stabilitate proba – probele de sange sunt stabile 48 ore la 2-4°C inainte de extractia acizilor nucleici⁴.

Metoda – Real-time PCR (TaqMan): reactie de polimerizare in lant cu detectie in timp real a produsului PCR  acumulat, prin masurarea fluorescentei emise (test cantitativ).⁴

Valori de referinta – HIV-1ARN: nedetectabil⁴.

Limita de detectie – 20 copii/mL⁴.

Interpretarea rezultatelor

Un rezultat nedetectabil indica faptul ca testul nu a detectat HIV-1 ARN in proba analizata. Un rezultat avand comentariul „HIV-1 ARN detectabil, dar <20 copii/mL” indica faptul ca a fost detectat HIV-1 ARN in proba, dar nivelul sau se afla sub limita inferioara de detectie a metodei; acest rezultat se poate datora unei viremii foarte mici, unei infectii HIV1 in stadiu precoce (<3 saptamani de la contactul infectant) sau a unei false pozitivitati (datorate unei imprecizii a testului in absenta infectiei)⁶.

In cazul copiilor nascuti din mame HIV pozitive rezultatele vor fi interpretate astfel:

-obtinerea a doua valori negative pentru HIV1-ARN la varsta de minimum 1 luna si respectiv la 4 luni (sau mai mult) infirma infectia;

-obtinerea a doua valori pozitive pentru HIV1-ARN la varsta de minimum 1 luna si respectiv la 4 luni (sau mai mult) confirma infectia³.

Limite si interferente

Nu se recomanda stabilirea unor decizii terapeutice pe baza unei singure valori a viremiei. Rezultatele viremiei trebuie interpretate intotdeauna in contextul clinic si corelate cu numarul celulelor CD4 pozitive⁶.

Variatiile diurne ale HIV ARN sunt mai mari la copii comparativ cu adultii; din acest motiv numai cresteri de peste 5 ori (0.7 log₁₀) pot fi semnificative la copiii <2 ani, fata de cresterile de peste 3 ori  (0.5 log₁₀) considerate ca fiind relevante la copiii mari si adulti³.

Introducerea tratamentului antiretroviral imediat dupa nastere poate suprima nivelele ARN-ului si interfera cu diagnosticul infectiei⁷.

Testul este optimizat doar pentru cuantificarea viremiei in infectia HIV-1 determinata de grupul M, subtipurile A-H si nu prezinta acuratete in detectarea infectiei cauzata de HIV-1 grupurile N si O, precum si a infectiei HIV-2.

Un rezultat negativ nu indica in mod necesar absenta replicarii virale^4;6.

Bibliografie

1. ARUP Laboratories. Test Directory: Human Immunodeficiency Virus 1 RNA Quantitative Real-Time PCR. www.aruplab.com 2010. Ref Type: Internet Communication.
2. Athe M.N. Tsibris. Martin S. Hirsch. Antiretroviral Therapy for Human Immunodeficiency Virus Infection. In Mandell, Douglas,and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th edition, Churchill Livingstone, Elsevier, 2010, 1847-1848.
3. Geoffrey A. Weinberg, George K. Siberry. Pediatric Human Immunodeficiency Virus. In Mandell, Douglas,and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th edition, Churchill Livingstone, Elsevier, 2010, 1818-1819.
4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.
5. Marvin S. Reitz, JR. Robert C.Gallo. Human Immunodeficiency Viruses. In Mandell, Douglas,and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th edition, Churchill Livingstone, Elsevier, 2010, 2323-2333.
6. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: HIV Type 1 Proviral DNA Qualitative Detection by PCR, Blood. HIV Type 1 RNA Quantification, Plasma. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
7. Robin Dewar, Deborah Goldstein, Frank Maldarelli. Diagnosis of Human Immnuodeficiency Virus Infection. In Mandell, Douglas,and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th edition, Churchill Livingstone, Elsevier, 2010, 1663-1681.
8. Timothy R. Sterling, Richard E. Chaisson. General Clinical Manifestations of Human Immunodeficiency Virus infection. In Mandell, Douglas,and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th edition, Churchill Livingstone, Elsevier, 2010, 1705-1721.