Hemocultura (cu antibiograma dupa caz)

Laborator Synevo

 

Informatii generale 

Hemocultura constituie una din metodele cele mai importante si delicate pentru laboratorul de microbiologie. Sangele, fiind in mod normal steril, izolarea si identificarea unei bacterii sau a unui fung in hemocultura are o semnificatie diagnostica considerabila¹³.

Bacteriemia este prezenta in sange a bacteriilor provenite dintr-un focar septic sau de pe o mucoasa lezata. Frecvent starea bacteriemica este lipsita de expresie clinica sau se insoteste numai de frison si febra la care se pot adauga simptome si semne proprii conditiei care a determinat descarcarea bacteriemica.

Septicemia este termenul clinic prin care se defineste o bacteriemie importanta cu evolutie clinica neregulata, imprevizibila si grava, acompaniata de frisoane, febra neregulata, toxemie, hipotensiune, prostratie, eruptii cutanate polimorfe si variate, metastaze septice tisulare sau viscerale. Gravitatea sindromului septicemic lasa pe al doilea plan simptomatologia focarului infectios primar, care trebuie insa intotdeauna cautat¹.

Germeni implicati in: 

Septicemie	Staphylococcus aureus, Escherichia coli si alte enterobacterii, stafilococ coagulazo-negativ (SCN), Pseudomonas spp, Streptococcus spp, bacterii anaerobe, levuri
Endocardita	Streptococcus spp., Enterococcus spp., Staphylococcus spp
Pneumopatii	Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae
Meningite	Neisseria meningitidis

 

In functie de poarta de intrare:

Pulmonara	Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae
Cutaneo-mucoasa ( cateter, dren )	Staphylococcus spp1
Extractii dentare	Streptococcus spp.
Digestiva (biliara, intestinala)	Enterobacterii, bacterii strict anaerobe, Enterococcus spp.
Ginecologica	Bacterii strict anaerobe, E.coli, Enterococcus spp.
Infectii si obstructii urinare	Enterobacterii, Enterococcus spp.

Principiul hemoculturii

Hemocultura este un test calitativ pentru detectarea microorganismelor prezente in sange. Sangele, prelevat in conditii de stricta asepsie, este insamantat in flaconul de hemocultura a carui compozitie favorizeaza dezvoltarea germenilor aerobi, anaerobi si microaerofili¹¹.

Principalii factori de imbogatire incorporati in mediu care favorizeaza dezvoltarea germenilor sunt:

• asociere de peptone, cazeina si gelatina pentru aportul de aminoacizi;
• extract de levuri pentru aportul de vitamine;
• hemine si NAD care permit dezvoltarea Haemophilus si favorizeaza cresterea unor germeni pretentiosi nutritiv cum sunt Actinobacillus spp, Cardiobacterium spp, Eikenella spp si alti anaerobi;
• vitamina B6, element indispensabil in dezvoltarea streptococului deficient intalnit in endocardite si a stafilococului;
• CO₂element important pentru cresterea germenilor din speciile: Neisseria, Brucella, Haemophilus, Streptococcus , Campylobacter.

Multiplicarea bacteriilor depinde insa si de o serie de factori independenti de conditiile de cultivare: densitatea germenilor in sange, stadiul lor de multiplicare,  prezenta in sange a unor substante inhibitorii.

Bacteriemiile si fungemiile adultilor evolueaza in general cu un numar redus de microorganisme circulante (intre 1-30 UFC/mL sange). La nou-nascut, sugar si copilul mic concentratia depaseste 100 UFC/mL. In general, intre gravitatea infectiei, prognostic si concentratia bacteriilor din sange exista o relatie direct proportionala³.

Bacteriile captate in flaconul de hemocultura pot fi:

• intacte, libere in plasma, in faza de multiplicare activa si vor continua sa se divida rapid in bulionul de hemocultura, sau in faza de repaus si vor incepe sa se multiplice la sfarsitul fazei de latenta corespunzatoare adaptarii la mediul nutritiv al flaconului;
• mai mult sau mai putin lezate sau mascate de actiunea sistemului anticorp-complement, antibiotice, fagocitate de polimorfonucleare sau monocite si se vor dezvolta dupa autoliza leucocitelor daca raman viabile;
• bacterii in forme L (deficiente nutritional) a caror crestere necesita un mediu adaptat (hipertonic si bogat in factori de crestere)¹².

Cresterea bacteriilor in hemocultura poate fi intarziata sau impiedicata daca nu se utilizeaza un anticoagulant in mediul de cultura, deoarece microorganismele risca sa fie capturate in cheagul de fibrina. In acelasi timp, unele  anticoagulante pot fi toxice fata de anumiti agenti patogeni la fel ca antibioticele prezente in sange. Aceste obstacole pot fi inlaturate daca se utilizeaza polyanetholsulfonat de sodiu (SPS), un anticoagulant netoxic care favorizeaza proliferarea bacteriana prin neutralizarea activitatii bactericide a serului uman si inhibarea actiunii unor antibiotice (Streptomicina, Kanamicina, Gentamicina, Polymixina B). SPS-ul poate avea rol inhibitor asupra unor suse de Peptostreptococcus, Neisseria, efect neutralizat de prezenta gelatinei in mediul de cultura.

Sunt comercializate sisteme semiautomate sau automate computerizate pentru detectia rapida a bacteriilor in hemoculturi. Principiile pe care se bazeaza aceste sisteme sunt multiple. Le mentionam doar pe cele pe care le utilizam in cadrul laboratorului Synevo: detectia directa a producerii CO₂, prin:

-scanarea seriata a esantioanelor de gaz rezultat in urma cresterii bacteriene in flaconul de hemocultura, ca in sistemul BACTEC (BACTEC 9050);

-fortarea fluidului de cultura (sub presiunea CO₂ degajat) sa treaca intr-un compartiment semnal de unde poate fi examinat microscopic si subcultivat, ca in OXOID SIGNAL SYSTEM⁹.

Recomandari pentru determinare

Se face la  indicatia  medicului in anumite situatii clinice cum sunt:

• toate cazurile cu febra de origine neprecizata, mai ales daca se acompaniaza de semne clinice evocatoare de infectie;
• sepsis, soc septic;
• pacienti cu endocardita acuta;
• sindrom sugestiv pentru infectie sistemica cu germeni specifici (febra enterica, bruceloza, leptospiroza);
• infectii localizate severe (meningite, pneumonii, supuratii intraabdominale).

Hemocultura este in plus motivata la:

• bolnavii imunodeprimati (cancer, toxicomani);
• pacientul care este supus unei agresiuni medicale (cateter, dializa sau interventii chirurgicale) si prezinta o stare febrila;
• in anumite situatii particulare (femeie insarcinata, pacient cardiac, diabetic, cu insuficienta renala, insuficienta hepatica) cand pacientul prezinta febra de origine neprecizata⁸.

Pregatirea pacientului

Prelevarea se efectueaza inainte de tratament antimicrobian, conform evolutiei predictive a curbei febrile sau in momentul in care bolnavul semnaleaza aparitia frisonului. In cazul in care acest lucru nu este posibil, sangele va fi prelevat imediat inaintea administrarii unei noi doze de antibiotic. Se indica prelevarea a trei probe intermitente in decurs de 24 de ore; in urgente ritmul este la un interval de 30-60 de minute⁶.

Specimen recoltat – sange venos, de preferinta à jeun (pe nemancate), hiperlipemia putand impiedica evidentierea unei cresteri bacteriene in mediul lichid.

Zona de electie pentru punctie este reprezentata de venele plicii cotului. Procedura de prelevare respecta normele de asepsie si antisepsie necesare pentru a evita contaminarea probei cu bacterii rezidente in flora tegumentara. Dupa recoltarea sangelui, proba de 10 mL sange, recoltata in seringa se introduce in recipientul cu mediul de cultura Signal prin inteparea capacului de cauciuc al acestuia in conditii de stricta asepsie. Flaconul se agita bland pentru omogenizarea acestuia in masa mediului. Pentru sistemul BACTEC recoltarea se face in recipientul de hemocultura pe principiul sistemelor inchise cu vid.

Proba se eticheteaza si se transporta in cel mai scurt timp de la recoltare la laborator, la temperaturi cat mai apropiate de 37ºC (cutie izoterma)⁸.

Materiale necesare – seringa sterila de 10  mL; flacon cu mediu de cultura Signal⁸; flacon cu mediul de cultura (BACTEC PLUS AEROBIC/F si PLUS ANAEROBIC/F^4;10;14 , BACTEC PÈDS PLUS™/F⁵ potrivit pentru probele pediatrice si volume mici de sange) pentru sistemul BACTEC.

Cantitate recoltata – adult:10 mL; copil:3-5 mL (Signal ) si intre 3-10 mL la adult si 1-3mL la copil (BACTEC)⁸.

Cauze de respingere a probei

• probe neetichetate;
• probe incorect recoltate (nu s-au respectat regulile de antisepsie);
• transport necorespunzator⁸.

Prelucrare necesara dupa recoltare – Sistem Signal: se ataseaza camera de expansiune livrata in acelasi kit. Se incubeaza la 37ºC. Durata incubarii la termostat si urmarirea probei este in medie de 7 zile. Se impune incubare mai prelungita la pacientii cu endocardita subacuta, la probele prelevate sub antibioticoterapie (pana la 14 zile) sau cand urmarim microorganisme exigente⁸.

Sistem BACTEC: se scaneaza codul de bare de pe flacon la cititorul de cod de bare si se introduce flaconul in pozitia indicata. Odata ce usa este inchisa, procesul incepe automat. Aparatul are o capacitate de 50 flacoane. El monitorizeaza permanent flacoanele de hemocultura incubate la 35^oC. Flacoanele sunt agitate continuu pentru a favoriza cresterea bacteriana. Flacoanele pozitive sunt semnalizate  sonor si visual. Sistemul efectueaza automat controlul de calitate la fiecare 10 minute. Softul integrat administreaza datele despre probe².

Metoda de lucru

1. Pentru kit-ul Signal-Oxoid; acesta este compus din:
2. a) recipient cu mediu Signal; compozitia acestui mediu permite dezvoltarea germenilor aerobi, anaerobi si microaerofili, ceea ce provoaca o crestere a presiunii detectata prin indicatorul de crestere adaptat flaconului (camera de expansiune);
3. b) camera de expansiune pentru mediu; in cazul multiplicarii bacteriene si cresterii presiunii, o parte din amestecul sange/bulion trece in aceasta camera si indica activitate bacteriana (hemocultura pozitiva)⁴.

Pentru urmarirea probelor se  foloseste  metoda clasica:

• Examinarea macroscopica – vizuala – de doua ori pe zi, a flacoanelor de hemocultura pentru a cauta semnele cresterii bacteriene. Este posibil ca aspectul flaconului sa orienteze asupra bacteriei in cauza, de exemplu:

1. a) turbiditate – bacili Gram negativi aerobi, Staphylococcus spp, Bacteroides spp;
2. b) hemoliza – Streptococcus spp, Staphylococcus spp, Lysteria spp, Clostridium spp, Bacillus spp;
3. c) producere de gaz – bacili Gram negativi aerobi si anaerobi;
4. d) coaguli – Staphylococcus aureus.

• Examinarea microscopica a preparatului proaspat si a frotiului colorat Gram efectuate din flaconul de hemocultura.

Mentiune: constanta agitare a recipientelor in primele 24h de incubare imbunatateste cresterea marii majoritati a bacteriilor aerobe^9;15.

Interpretarea  culturilor in sistemul Signal

Absenta cresterii – mediul din recipientul Signal ramane limpede si nu trece de mansonul verde al camerei de expansiune. In primele 6-12 ore de incubare se pot face subculturi oarbe (inocularea pe geloza chocolat in atmosfera de CO₂ la 35ºC pentru alte 48h sau in bulion thyoglicolat cu resazurina) si frotiuri care se vor colora Gram (examinare microscopica).

Recipientele cu crestere absenta vor fi reincubate si urmarite in continuare.

Hemocultura pozitiva – daca in sangele de cercetat au existat germeni care s-au multiplicat in mediul de cultura (hemocultura pozitiva), mediul va trece in camera de expansiune si se va ridica deasupra mansonului verde al acesteia.

1. Pentru sistemul BACTEC principiul de lucru este urmatorul:

Prin activitatea metabolica microorganismele din flacon elibereaza CO₂, iar flacoanele continand un marker de activare care devine fluorescent in contactul cu CO₂ detecteaza prezenta acestuia. Fotodetectorul aparatului masoara nivelul de fluorescenta si trimite datele spre computer. Masuratoarea este interpretata de sistem in functie de parametrii de pozitivitate programati in prealabil. Computerul identifica flaconul pozitiv care este semnalat auditiv si vizual prin aprinderea unui beculet. Pe ecranul de afisaj al aparatului apare pozitia grafica a flaconului detectat pozitiv.

Fiind un sistem complet automat  flacoanele sunt monitorizate la fiecare 10 minute ceea ce permite detectarea imediata a flacoanelor pozitive .

Protocolul  de monitorizare este de 7 zile – dar dezvoltarea microorganismelor poate fi detectata dupa 8 ore^2;4;10;14.

1. Hemoculturile pozitive se prelucreaza astfel:

Sistemul Signal: Se preleveaza din zona inferioara a camerei de expansiune o cantitate mica de mediu. Accesul in camera de expansiune se face prin partea superioara a acesteia, printr-o manevra sterila. Aceasta manevra nu poate contamina continutul recipientului Signal.

Sistemul BACTEC: printr-un ac atasat flaconului se preleveaza o cantitate de mediu din care se executa frotiuri si se insamanteaza pe mediile de cultura².

Mediul prelevat se foloseste pentru:

1. a) intindere de frotiuri pe lame de microscopie; acestea se examineaza dupa colorare Gram. In raport cu rezultatul citirilor se fac repicari.
2. b) repicari pe medii solide si lichide in functie de bacteria evidentiata microscopic: geloza-sange/Columbia-sange, agar-chocolat, Levine/MacConkey, Sabouraud cu Cloramfenicol,  bulion thioglycolat  cu resazurina.
3. c) placile se incubeaza, in functie de bacteria evidentiata microscopic, la o temperatura de 35ºC-37ºC in conditii de aerobioza, in atmosfera cu 5-7% CO₂sau in anaerobioza (GasPack +amestec reducator) pentru 48-72 de ore. Se examineaza coloniile izolate.
4. d) teste necesare pentru identificare: ID catalaza, trusa de identificare stafilococ, trusa de identificare streptococ, discuri de Optochin, factori X, V si XV, medii politrope pentru enterobacterii, reactia oxidazei, teste API ( API 20E , API 20NE, API NH, etc)  teste pentru identificarea levurilor. Identificarea  se poate face si  automat pe sistemul Vitek.
5. e) testarea sensibilitatii la antibiotice sau antifungice prin metoda difuzimetrica sau automata pe Vitek⁹.
6.  Eliberarea  rezultatelor
7. a) rezultat partial prin frotiu colorat Gram – se consemneaza si se anunta telefonic;
8. b) rezultat definitiv dupa izolarea, identificarea bacteriei si efectuarea antibiogramei sau antifungigramei.

Interpretarea rezultatului final se face in functie de contextul clinic si de numarul flacoanelor pozitive in raport cu cele recoltate⁹.

Hemoculturi pozitive

Se iau in considerare:

• mai multe hemoculturi pozitive cu un germen patogen;
•  mai multe hemoculturi pozitive cu un germen obisnuit comensal intr-un anumit context clinic;
• 1 hemocultura pozitiva cu germeni patogeni cunoscuti (Salmonella spp);
• 1 hemocultura pozitiva cu germeni potential patogeni in context clinic evocator cum ar fi: Streptococcus pneumoniae in pneumopatii, enterobacterii in infectii urinare, stafilococ coagulazo-negativ in infectii de cateter.

Se exclud:

• 1 hemocultura pozitiva cu un germen comensal fara context clinic: suprainfectie cu stafilococ coagulazo-negativ, corynebacterii, streptococ non-grupabil;
• pe un teren imunologic deprimat se iau in considerare si aceste bacterii;
• pe un teren imunologic normal se repeta hemocultura.

Hemoculturi negative

• recoltarea probei s-a realizat dupa antibioticoterapie;
• recoltarea s-a realizat tardiv in cursul bolii (apar anticorpii);
• cantitate insuficienta de sange recoltat;
• timp de observatie prea scurt;
• mediu de cultura gresit ales.

Hemoculturi pozitive pentru mai multe specii bacteriene

In cazul in care s-au izolat mai multe specii bacteriene intr-un singur flacon sau din flacoane diferite ale aceluiasi pacient, acestea se tin in observatie in urmatoarele situatii :

• bolnav imuno-deprimat;
• bolnav comatos;
• cateter mentinut timp indelungat.

Specii bacteriene izolate in functie de perioada de crestere

• in primele 1-2 zile cresc: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus spp, enterobacterii;
• dupa 3 zile cresc: bacilii Gram negativi non-fermentativi, bacteriile anaerobe;
• la 4-5 zile: Haemophilus spp si stafilococul coagulazo-negativ;
• la 6-7 zile: speciile de Candida;
• la 9 zile: corynebacteriile⁹.

Limite si interferente

• tratament antimicrobian aplicat inaintea prelevarii;
• contaminarea sangelui cu flora exogena;
• cantitate insuficienta de sange prelevat;
• frecventa si momentul recoltarilor gresit stabilite;
• mediu de incubare si repicare gresit alese;
• timp de incubare necorespunzator^1;6;12.

 Bibliografie

1. Akiyama H., Kanzaki H., Tada J., Arata J. Coagulase-negative staphylococci isolated from various skin lesions. In D Dermatol, 25: 563-8. 1998. Ref Type: Journal (Full).
2. Becton Dickinson and Co., Bactec 9050. Sisteme pentru microbiologie Becton Dickinson, Sparks, Maryland 21152 USA, 1997
3. Dumitru Buiuc. Hemocultura in diagnosticul infectiei. In Tratat de Microbiologie Clinica. Dumitru Buiuc, Marian Negut, Editura Medicala, Romania, 2 ed. 2008, 165-182.
4. Goldenbaum P., Stafford E., Talbot B. Laboratory Study of the Neutralization of Antimicrobials by Resin-Containing Blood Culture Medium, Sixth European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 1993, 28-31.
5. Hardy L., Crowther L., Goldenbaum P., Beaty S.. Sixth European Congress of Clinical MIcrobiology and Infectious Diseases, 1993, 28-31.
6. Joseph M.Civetta, Robert W.Taylor, Robert R. Kirby. Critical care. In Lippincott Raven ed. 1997; 28:405-412.
7. Koontz FP., Flint KK., Reynolds JK., Allen S. Multicenter Comparison of High Volume (10ml) nr BACTEC Plus and the Standard (5ml) nr. BACTEC System. In Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 1991, 14: 111-8.
8. Kumar P.J., Clark M.L. In Clinical Medicine. Bailliere Tindall, UK, 2 ed. 1990, 710-720.
9. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.
10. Levievre H., Gimenez M., Vandenesch F. and al. Multicenter Clinical Comparison of Resin-Containing Bottles with Standard Aerobic and Anaerobic Bottles for Culture of Microorganisms from Blood. In Eur.J. Clin. Microbiol. Infect.Dis., 1997, 16:669-674.
11. Loulergue J., Avril J.L., Omwanga D. Hemocultures. In Etude des produits pathologiques. Maury- Imprimeur S.A ed. 1987, 41-45.
12. Philippona A., Paul C., Nevot P. L’hemoculture. In Rev.Prat , 33:1929-38. 1983. Ref Type: Journal (Full)
13. Reimer L.G, Wilson M.L., Weinstein M.P. Update on detection of bacteriemia and fungemia. In Clin. Microbiol. Rev., 10:445-465. 1997. Ref Type: Journal (Full).
14. Rohner P., Pepey Beatrice, Auckenthaler R., Advantage of Combining Resin with Lytic BACTEC Blood Culture Media. In J. Clin. Microbiol., 1997, 35(10): 2634-8
15. Weinstein M.P. Current blood culture methods and systems: clinical concepts, technology and interpretation of results. In Clin.Infect.Dis , 23:40-46. 1996. Ref Type: Journal (Full).