Bursttest explozia oxidativa a neutrofilului

Laborator Synevo

 

Informatii generale si recomandari pentru efectuarea testului

Neutrofilele detin un rol important in raspunsul imun nespecific, in special in rezistenta antibacteriana,  ca celule efectoare, inductoare si reglatoare. Printre caracteristicile lor esentiale se numara:

• marginatia si aderarea la celulele endoteliului vascular;
• traversarea peretelui vascular (diapedeza) si migrarea catre focarele de inflamatie;
• recunoasterea si fagocitarea moleculelor opsonizate;
• degradarea si distrugerea acestor molecule prin generarea de radicali toxici de oxigen.

Aceste caracteristici sunt facilitate de prezenta de receptori aflati la suprafata si in interiorul celulelor, cum ar fi receptorii pentru citokine, neuromediatori, autacoizi si hormoni.

Chemotactismul neutrofilelor se produce ca raspuns la factorii chemotactici (chemotaxine) generati la nivelul focarului lezional. Mai mult, chemotaxinele intensifica metabolismul neutrofilelor, agregarea acestora si actiunile bactericide.

Fagocitoza este mediata de opsonine circulante, specifice (imunoglobuline IgG) sau nespecifice (componente ale complementului), neutrofilele avand receptori pentru fragmentul Fc al imunoglobulinelor IgG1, IgG2 si pentru fragmentul complementului iC3b (C3b inactivat). Microorganismele absorbite si opsonizate sunt distruse atat prin mecanisme oxigen-dependente cat si oxigen-independente. Radicalii liberi de oxigen degradeaza bacteriile absobite in fagozomi si sunt partial eliberati in mediul inconjurator unde intensifica distrugerea microorganismelor si determina simultan lezarea tesuturilor. Procesul este caracteristic inflamatiei acute, fiind mult mai rar intalnit in afectiunile inflamatorii cronice. Distrugerea microorganismelor se mai poate produce si prin intermediul proteinelor prezente in granulatiile azurofiele cum ar fi: catepsina G, lizozimul, interferonii etc.

Mediatorii inflamatiei, citokinele (de exemplu, TNFα) si selectinele cresc abilitatea granulocitelor de a se localiza la nivelul focarului de inflamatie. Capacitatea de fagocitoza este crescuta prin intensificarea productiei de radicali de oxigen si prin eliberarea enzimelor lizozomale. TNFα este un factor important care potenteaza activitatea fagocitara si citotoxica a neutrofilelor. La randul lor, granulocitele activate secreta citokine; IL-1 care stimuleaza productia de IL-8 de catre monocite, celule endoteliale si fibroblasti, creste expresia moleculelor de adeziune CD11b/CD18 si generarea de radicali de oxigen. Interferonul gamma este o citokina puternica care intensifica expresia receptorului Fc, stimuleaza modificarile oxigenului precum si eliberarea granulelor din neutrofile¹.

Datorita caracteristicilor mentionate granulocitele sunt implicate in raspunsul inflamator precoce, iar anomaliile functionale ale acestora, survenite in oricare din etape, determina deficiente semnificative ale  imunitatii celulare⁵.

O activitate redusa sau absenta de generare a exploziei oxidative in neutrofile sau monocite este intalnita in unele defecte mostenite cum ar fi boala granulomatoasa cronica (CGD). CGD reprezinta un grup heterogen de afectiuni cu transmitere X-linkata sau autozomal recesiva avand la baza mutatii genetice multiple.  Ca urmare a acestor anomalii este afectata una din cele patru subunitati ale enzimei NADPH oxidaza ce catalizeaza formarea peroxidului de hidrogen. Procesul de fagocitoza se desfasoara normal insa este perturbat metabolismul oxidativ – oxigenul molecular nu mai este redus la anionul superoxid si la alti radicali liberi (radical hidroxil si peroxid de hidrogen) ce reprezinta componente importante ale mecanismului intracelular de distrugere a bacteriilor.

Pacientii cu CGD prezinta infectii recurente cu microorganisme producatoare de catalaza, cum ar fi Staphylococcus aureus, care sunt capabili sa distruga peroxidul de oxigen generat de neutrofile. Aceste microorganisme supravietuiesc ingestiei intracelulare, se multiplica si determina o reactie granulomatoasa din partea tesuturilor, care atunci cand devine excesiva poate obstructiona tracturile gastrointestinal si genitourinar. Alte organe ce pot fi afectate de granuloame sunt plamanul, ganglionii limfatici, ficatul, osul. Infectiile cronice cu Serratia spp., Klebsiella spp., Burkholderia cepacia siAspergillus spp., sunt in special problematice. De mentionat ca pacientii cu CGD nu sufera infectii cu microorganisme catalazo-negative. Debutul bolii are loc de obicei in primii doi ani de viata^2;3;4.

Explozia oxidativa a neutrofilelor poate fi afectata si la pacientii cu transplant precum si la cei cu SIDA.

Anumite imunomodulatoare (citokine: GM-CSF, G-CSF, TNFα) pot avea un oarecare efect si asupra metabolismului oxidativ celular⁴.

Caracteristica principala a neutrofilelor in CGD este aceea ca dupa stimulare nu sunt capabile sa produca o explozie oxidativa semnificativa. Metoda clasica pentru screening-ul acestei afectiuni utilizeaza un colorant – albastru-nitrat de tetrazol (nitroblue tetrazolium – NTB test) ce este incubat impreuna cu neutrofilele stimulate ale pacientului; neutrofilele functionale fagociteaza, reduc si precipita colorantul NTB galben rezultand depozite intracelulare de formazan negru-albastrui; aceste depozite reprezinta un indicator al formarii intracelulare de peroxid de hidrogen; in urma examinarii microscopice se efectueaza un scor al neutrofilelor ce contin depozite intracelulare de formazan³.

In laboratorul nostru testul NBT a fost inlocuit de Burstest care foloseste citometria in flux pentru a evalua metabolismul oxidativ alterat al neutrofilelor din CGD sau alte afectiuni si pentru a studia efectul unor medicamente imunomodulatoare⁴.

Pregatire pacient – se va evita recoltarea probei in cursul unei infectii acute⁴.

Specimen recoltat – sange venos⁴. 

Recipient de recoltare – vacutainer cu heparinat de litiu⁴.

Volum proba – minim 10 mL sange heparinat⁴.

Stabilitate proba – sangele trebuie sa ajunga in maxim 24 ore la laboratorul la care se efectueaza testul si in aceasta perioada se pastreaza la temperatura camerei. Este contraindicata refrigerarea probei⁴.

Cauze de respingere a probei – specimene care au depasit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau congelate⁴.

Metoda – citometrie in flux.

Burstest permite evaluarea cantitativa a exploziei oxidative din neutrofile si monocite. Se utilizeaza bacterii (E. coli) opsonizate nemarcate ca particule stimulante, ligandul de proteinkinaza C (PMA – forbol12-miristat 13-acetat) ca stimul puternic, independent de receptori si peptidul chemotactic N-formil-MetLeuPhe (fMLP)  ca stimul fiziologic slab. Sangele heparinat al pacientului este incubat cu stimulii mentionati la 37°C; se utilizeaza si o proba cu rol de control negativ care nu este incubata cu stimuli; dupa stimulare, neutrofilele si monocitele produc specii reactive de oxigen care distrug bacteriile din interiorul fagozomului; formarea acestor compusi este monitorizata prin adaugarea unui substrat fluorogenic – dihidrorodamina (DHR) – care odata oxidat va genera produsi intracelulari fluorescenti detectati ulterior prin citometrie in flux; reactia este stopata prin adaugarea solutiei de liza ce indeparteaza eritrocitele si determina o fixare partiala a leucocitelor; solutia de colorare a ADN-ului, adaugata inaintea analizei prin citometrie in flux, exclude artefactele generate de agregatele bacteriene care au proprietati de dispersare a luminii asemanatoare leucocitelor; se utilizeaza un laser cu argon (488 nm, lumina albastra); pentru fiecare proba se colecteaza prin “gating”  10000-15000 leucocite; sunt analizate atat procentul de celule (neutrofile si monocite) care au produs specii reactive de oxigen (recrutare), cat si intensitatea medie a fluorescentei acestora (activitatea, cantitatea de substrat clivat); in acest scop se va efectua un “gating” pe grupul leucocitar relevant si se va analiza histograma fluorescentei verzi a acestuia (FL1); prin utilizarea controlului negativ se va seta un marker pentru fluorescenta-1 (FL1) astfel incat sub 1% din evenimente sa fie pozitive; procentul de celule care produc specii reactive de oxigen va putea fi apoi determinat prin numararea evenimentelor localizate deasupra marker-ului; intensitatea medie a fluorescentei se coreleaza cu numarul de produsi generati de catre un singur leucocit⁴.

Valori de referinta si comunicarea rezultatelor

Sunt raportati urmatorii parametri:

Procentul de neutrofile care produce specii reactive de oxigen: >84%

Activitate oxidativa neutrofile: >550 mfi

mfi = intenistatea medie a fluorescentei⁴.

Limite

Probele cu un numar de leucocite aflat in afara intervalului de referinta necesita o corectie a cantitatii de bacterii adaugate⁴.

Bibliografie

1. Anatol Panasiuk, Jolanta Wysoka, Elzbieta Maciorkowska, Bozena Panasiuk, Danuta Prokopowicz, Janusz Zak, Karol Radomski. Phagocytic and oxidative burst activity of neutrophils in the end stage of liver cirrhosis. In World Journal of Gastroenterology 2005; 11(48):7661-7665.
2. Francesco Dati & Erwin Metzmann. Immunodeficiencies: Characteristics and laboratory findings. In Proteins Laboratory Testing and Clinical Use, Media Print Taunusdruck GmbH, Frankfurt am Main; 2005,187.
3. Kimberley W. Sanford, Susan D. Roseff. Immunodeficiency Disorders. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Saunders-Elsevier, 21st Edition, 911.
4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2011. Ref Type: Catalog.
5. Roger S. Riley, Jonathan Ben-Ezra. Laboratory Evaluation of the Cellular Immune System. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Saunders-Elsevier, 21st Edition, 826-830.