Yersinia-Anticorpi IgG, IgA

Laborator Synevo

 

Informatii generale si recomandari pentru determinarea anticorpilor anti-Yersinia

Yersiniile sunt Enterobacteriaceae Gram negative cu morfologie cocobacilara. In genul Yersinia sunt incluse 12 specii dintre care numai trei, Y. pestis, Y. pseudotuberculosis si Y. enterocolitica au fost izolate de la om, celelalte fiind prezente doar in sol si ape, ori patogene pentru mamiferele salbatice, pasari si pesti^3;4.

Yersinia pestis are ca rezervor principal rozatoarele. De la animale Y. pestis se transmite la om prin intermediul puricilor sobolanului (Xenopsilla cheopis), in proventricolul  si stomacul carora  supravietuieste timp indelungat, sau prin praf de dejecte ori  produse animaliere. Interuman pesta este transmisa prin puricele Pulex irritans si, frecvent, prin inhalare de picaturi Flϋgge de la pacient in faza prodromala sau acuta a pestei pulmonare.

Yersinia pseudotuberculosis are ca rezervor natural rozatoare si pasari salbatice de unde ajunge pe sol si in ape unde supravietuieste activ, chiar si la temperaturi joase. La om este transmisa pe cale digestiva si este cauza unor enterite subacute insotite de adenopatie mezenterica  marcata ce poate mima apendicita³. Tabloul clinic include febra, diaree si dureri abdominale, cu durata de 1-3 saptamani; greata si varsaturile se adauga in 15-40% din cazuri. In materiile fecale pot fi detectate leucocite, sange sau mucus. Cazurile grave se pot complica cu perforatii ileale sau rectoragii. Pacientii cu adenita mezenterica sau ileita terminala prezinta febra, dureri si aparare musculara in fosa iliaca dreapta insotite de leucocitoza; sunt afectati predominat copiii mari si adolescentii. In aceste cazuri tabloul nu poate fi diferentiat de apendicita acuta si adesea se intervine chirurgical.

Septicemia indusa de Yersinia pseudotuberculosis este rar raportata; aproximativ 50% dintre pacientii septicemici prezinta o afectiune cronica de baza. Un sindrom asemanator scarlatinei a fost descris in asociere cu anumite tulpini de Y. pseudotuberculosis in estul Rusiei si Japonia; aceasta conditie este explicata prin producerea unui mitogen, un superantigen unic omolog celui implicat in sindromul socului toxic indus de stafilococi si streptococi. In plus, date recente indica implicarea bacteriei in boala Kawasaki, infectia fiind asociata cu o frecventa crescuta a leziunilor arteriale⁴.

Artrita reactiva apare ca o complicatie la aproximativ 15% dintre pacienti; debuteaza intr-un interval de cateva zile pana la o luna de la episodul diareic acut si poate afecta articulatiile genunchiului, gleznei, incheieturii mainii si degetelor. In majoritatea cazurilor 2-4 articulatii devin inflamate intr-o succesiune rapida in decurs de 2-14 zile. In doua treimi din cazuri simptomele persista mai mult de o luna, iar intr-o treime peste 4 luni. Dupa 12 luni cei multi dintre pacienti devin asimptomatici, insa cativa pacienti prezinta durere lombosacrata persistenta datorita sacroileitei asociata specific cu prezenta antigenului de histocompatibilitate HLA B27. Rareori se produce spondilita ankilopoietica. Lichidul articular este steril, iar examenul microscopic indica o pleiocitoza polimorfo-nucleara.  Sindromul Reiter (artrita, conjunctivita si uretrita) apare in 5% din cazuri, de asemenea mai frecvent la persoanele HLA-B27 pozitive^1;4.

Eritemul nodos se produce in 30% din cazurile de infectie din regiunea Scandinaviei. Leziunile cutanate se dezvolta tipic pe membrele inferioare si trunchi in decurs de 2-20 zile de la debutul febrei si durerilor abdominale si se remite spontan, in majoritatea cazurilor, intr-un interval de o luna. Femeile sunt de doua ori mai frecvent afectate decat barbatii⁴.

Yersinia enterocolitica are ca rezervor natural mamiferele salbatice  si domestice intre care porcul este una din sursele importante pentru om. A fost izolata dintr-o gama larga de produse alimentare (contaminate in perioada procesarii) unde rezista timp indelungat in stare biologic activa  (carne refrigerata ori prelucrata sub forma a diferite produse netratate termic, lapte, branzeturi si chiar ciocolata). Determina o patologie polimorfa; la copil  sunt mai frecvente afectiunile intestinale (enterite, sindromul dureros al fosei iliace drepte), iar la adult artritele reactive si eritemul nodos (formele extraintestinale sunt de obicei precedate de sindrom enteral)³. Din spectrul infectiilor cauzate de Y. enterocolitica face parte si faringita exsudativa. Septicemia se produce rar, in special la pacientii imunodeprimati, si are adesea o evolutie letala; se poate complica cu abcese hepatice sau splenice, peritonita, artrita septica, osteomielita, infectii ale plagilor, meningita, endocardita si anevrisme micotice.

Pentru diagnosticul infectiilor acute cu Yersinia bacteria este izolata din diverse produse patologice. Testele serologice sunt utile mai ales in diagnosticul artritei reactive si a infectiilor cronice. Anticorpii aglutinanti apar imediat dupa debutul bolii, ating un varf in cea de-a doua saptamana si dispar in general in decurs de 2-6 luni⁴.

Pregatire pacient – preferabil à jeun (pe nemancate)⁵.    

Specimen recoltat – sange venos⁵.

Recipient de recoltare – vacutainer fara anticoagulant cu/fara gel separator⁵.

Prelucrare necesara dupa recoltare – se separa serul prin centrifugare⁵.

Volum proba – minim 2 mL ser⁵.

Cauze de respingere a probei –  specimen intens hemolizat, hemolitic sau contaminat bacterian⁵.

Stabilitate proba –  2 saptamani la 2-8°C; timp indelungat la -20°C; evitati decongelarea/recongelarea repetata⁵.

Metoda – Western blot⁵.

Anticorpii detectati prin aceasta metoda sunt indreptati impotriva celor 3 specii de Yersinia: enterocolitica, pseudotuberculosis si pestis.

Testul utilizeaza antigene secretorii provenite de la Yersinia (Yop: Yersinia outer proteins) relevante serologic, care sunt separate pe baza greutatii moleculare prin electroforeza in gel de poliacrilamida in prezenta de sodium dodecil sulfat (SDS-PAGE) si transferate ulterior electroforetic pe o membrana de nitroceluloza (Western blotting). Situsurile de legare libere de pe membrana sunt saturate cu o solutie de proteine, dupa care matricea este spalata si taiata in fasii (strip-uri). Antigenele sunt reprezentate, in ordinea fixarii pe strip, de:

YopH: 51 kDa; protein-tirozin-fosfataza implicata in transductia semnalelor; impreuna cu YopE inhiba activitatea macrofagelor; citotoxina.

YopM: 44 Kda; se leaga de α-trombina umana.

YopB: 41 kDa; proteina transmembranara implicata in formarea porilor; transporta YopE si Yop H; supresor al TNF-alfa.

LcrV: 37 kDa; reglarea genei Yop.

YopD: 35 kDa; proteina transmembranara; transporta YopE si Yop H.

YopN: 33 kDa; senzor Ca²⁺; implicat in reglarea Yop.

YopE: 23 kDa; inhiba fagocitoza prin depolimerizarea filamentelor de actina.

Pentru detectarea anticorpilor specifici anti-Yersinia strip-ul incarcat cu antigene este incubat impreuna cu serul diluat al pacientului. Daca in ser sunt prezenti anticorpi specifici, acestia se vor lega de antigenele corespunzatoare de pe strip. Dupa o etapa de spalare, strip-ul este incubat, in functie de clasa de anticorpi testata, cu un conjugat anti-IgG sau anti-IgA uman marcat cu fosfataza alcalina. Conjugatul se va atasa la complexul antigen-anticorp format. Dupa indepartarea prin spalare a conjugatului nelegat se adauga substratul cromogen. Daca este prezent conjugatul legat, reactia enzimatica va genera un produs colorat violet la nivelul benzilor ocupate de anticorpii specifici. Astfel, benzile vizualizate la nivelul strip-ului sunt rezultatul legarii anticorpilor specifici de antigenele individuale⁵.

Valori de referinta  si interpretarea rezultatelor:

Fiecare strip contine in partea superioara o banda de control care reprezinta controlul reactiei necesar pentru a confirma efectuarea corecta a testului. Testul este validat daca este vizibila banda YopD (35 kDa) a controlului IgA si IgG.

Evaluarea intensitatii benzilor aparute in serul pacientilor se realizeaza folosind drept referinta banda de control. Benzile a caror intensitate este mai mare sau egala cu cea a controlului vor fi marcate cu X in protocolul de lucru; benzile foarte intense vor fi marcate cu XX; benzile de intensitate mai slaba decat cea a controlului nu vor fi luate in considerare.

Yersinia IgG

Rezultat pozitiv la limita: obtinerea unei benzi YopD (35 kDa) de intensitate X; suspiciune de infectie cu Yersinia; se recomanda control peste 3-4 saptamani.

Rezultat pozitiv: obtinerea unei benzi YopD (35 kDa) de intensitate XX sau a cel putin 2 benzi dintre urmatoarele: 51, 44, 41, 37, 35, 33 sau 23 kDa; sunt prezenti anticorpi specifici anti-Yersinia IgG.

Yersinia IgA

Rezultat pozitiv: obtinerea unei benzi YopD (35 kDa) de intensitate X sau XX sau a cel putin 2 benzi dintre urmatoarele: 51, 44, 41, 37, 35, 33 sau 23 kDa; sunt prezenti anticorpi specifici anti-Yersinia IgA.

Semnificatia anticorpilor anti-Yersinia pentru diagnostic

• Anticorpii IgGsunt produsi in cazul yersiniozei acute, artritei reactive asociate cu Yersinia si al yersiniozei cronice. In stadiul incipient al unei yersinioze anticorpii sunt rareori detectabili. Anticorpii IgG persista minimum 5 luni de la debutul bolii, cel mai adesea insa o perioada indelungata (peste 5 ani). Anticorpii IgG sunt indreptati impotriva tuturor proteinelor secretate de Yersinia, insa cel mai adesea fata de YopE (23 kD), YopD (35 kD), YopB (41kD) si YopH (51 kD).
• Anticorpii IgAapar in mod pregnant in faza incipienta a yersiniozei acute. In cazul artritei reactive asociate cu Yersinia, raspunsul IgA este indreptat in 90% din cazuri impotriva antigenului YopD (35kD). In cazul yersiniozei cronice anticorpii IgA sunt indreptati in mod detectabil impotriva YopE (23 kD), YopD (35 kD) si YopB (41kD). In cazul yersiniozelor complicate anticorpii IgA persista in majoritatea cazurilor mai multi ani, iar in cazul yersiniozelor necomplicate, de regula, numai cateva luni. Tratamentul cu antibiotice conduce la o scadere drastica a titrului IgA⁵.

Limite si interferente

Medicamente si imunoglobuline pot conduce la reactii nespecifice⁵.

Bibliografie

1. ARUP Laboratories. Test Directory: Yersinia Species Antibodies, IgA & IgG by Western Blot. www.aruplab.com 2009. Ref Type: Internet Communication.
2. David T Dennis, Paul S Mead. Yersinia Species, Inclding Plague. In Mandell, Douglas, and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th edition, Churchill Livingstone, Elsevier, 2010, 2949-2951.
3. Dumitru Buiuc, Marian Negut. Identificarea bacililor gram-negativi aerobi glucozo-fermentativi. In Tratat de microbiologie clinica, Ed. Medicala, ed 2, 2008, 734-738.
4. Gerri S. Hall, Gail L.Woods. Medical Bacteriology. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Saunders-Elsevier, 21st Edition, 1030-1031.
5. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.