Virusul hepatitei C – genotipare

Laboratorul Synevo

Informatii generale si recomandari

Asemenea altor virusuri ARN, VHC prezinta la nivel nucleotidic o diversitate genetica considerabila generata de rata inalta a mutatiilor virusului. Pentru a structura intr-un anume mod aceasta diversitate genetica a fost formulata o clasificare VHC in 6 genotipuri (denumite 1, 2, 3, 4, 5, 6) pe baza analizei filogenetice a secventei genomice. Fiecare genotip, la randul sau, este subdivizat filogenetic in unul sau mai multe subtipuri (denumite a, b, c, etc). Aceste denumiri au devenit sistemul standard pentru noua nomenclatura a genotipurilor HCV^10;11. In plus, la persoanele infectate VHC circula si se comporta ca un amestec de populatii virale distincte denumite cvasispecii.

Cele 6 tipuri genetice majore difera unul de celalalt la nivelul secventelor nucleotidice in proportie de 30-35%; intre subtipuri se inregistreaza o diferenta de 20-25%, iar in cadrul aceluiasi subtip, o diferenta de pana la 10%.

Genomul VHC este alcatuit din domenii care difera mult in ceea ce priveste rata mutatiilor si variabilitatea secventelor nucleotidice. Astfel, regiunea netranslatata de la capatul 5’ al genomului (5’UTR) reprezinta domeniul cel mai bine conservat, cu rata evolutiva cea mai lenta. Urmeaza apoi gena C (core) care codifica miezul nucleocapsidic proteic si care evolueaza de trei ori mai rapid in comparatie cu regiunea 5’UTR. Genele care codifica proteinele de invelis E1 si E2 constituie regiunea hipervariabila, care difera de la un izolat la altul. Aceasta permite virusului sa evite mecanismele imunologice ale gazdelor indreptate impotriva proteinelor accesibile din invelisul viral.

Genotipurile si subtipurile HCV prezinta modele complexe de distributie geografica, prevalenta relativa si moduri de transmitere a infectiei ce pot fi mai bine intelese daca sunt clasificate in trei grupuri:

1. grupul epidemiccuprinde subtipurile 1a, 1b, 2a, 2b si 3a, care au o distributie globala si sunt responsabile pentru majoritatea infectiilor din intreaga lume. Raspandirea globala rapida a acestor subtipuri rezulta din transmiterea lor eficienta prin produse de sange infectate si administrarea de droguri intravenoase. Subtipurile 1b si 2a sunt asociate predominat cu transmiterea prin produse de sange iar prevalenta lor relativa a scazut in ultimii ani ca urmare a imbunatatirii screening-ului donatorilor. Subtipurile 1a si 3a se intalnesc in principal la dependentii de droguri iar prevalenta acestora este in crestere.
2. grupul endemicare o distributie mai redusa decat grupul epidemic fiind limitat la anumite regiuni. De exemplu, subtipurile genotipului 6 se gasesc numai in sud-estul Asiei. Diversitatea genetica foarte mare a tulpinilor endemice sugereaza o persistenta indelungata a infectiei in aceste regiuni datorita mentinerii unor modalitati de transmitere relativ ineficiente, printre care se numara si cea sexuala.
3. grupul local epidemicprezinta o prevalenta mare in anumite regiuni si populatii ale globului. Astfel, subtipul 4a este responsabil de infectarea a mai mult de 10% din populatia Egiptului si este rar intalnit in afara Orientului Mijlociu. Studiile epidemiologice sugereaza ca acest fenomen a avut loc in cursul secolului XX, cu ocazia administrarii in masa pe cale intravenoasa a unor medicamente impotriva schistosomiazei¹¹.

  In tara noastra predomina genotipul 1b si un amestec de genotipuri 1a si 1b⁴. Un studiu efectuat recent la Institutul Matei Bals in Bucuresti pe 670 pacienti a indicat o prevalenta de 99.7% a genotipului 1 VHC⁶.

Cunoasterea genotipului viral ofera informatii cu valoare prognostica in ceea ce priveste eficacitatea terapiei la pacientii cu hepatita virala cronica VHC. Spre exemplu, genotipul 1b (dobandit cel mai adesea post-transfuzional) se asociaza cu un raspuns slab la tratament si cu un risc crescut de ciroza si carcinom hepato-celular. Pe de alta parte, genotipurile 2 si 3 (dobandite predominat prin consumuri de droguri i.v.) se asociaza cu un raspuns favorabil la terapia antivirala^7;8;9.

US National Institute of Health (NIH) arata in 2002 ca determinarea genotipurilor VHC este importanta in alegerea dozelor optime de interferon si ribavirina precum si a duratei tratamentului. Astfel, la pacientii cu genotip salbatic 1 se recomanda o durata a tratamentului de 48 de saptamani, iar pentru pacientii cu genotip 2 si 3 o durata de 24 de saptamani cu doze mai mici de ribavirina. Este util ca genotiparea HCV sa fie efectuata in toate infectiile cu virus C inaintea inceperii oricarui tratament¹.

Testul efectuat in laboratorul nostru foloseste o tehnica PCR de amplificare a unor regiuni ale genomului VHC urmata de revers-hibridizare pentru identificarea genotipurilor HCV de la 1 la 6 si a subtipurilor a si b ale genotipului 1⁵.

Regiunea 5’UTR prezinta multiple secvente specifice fiecarui genotip distribuite de-a lungul a 7 mici regiuni variabile care pot da informatii precise despre genotipurile 1-5 si subtipurile a si b ale genotipului 6. Datorita marii similitudini secventiale, subtipurile c-l ale genotipului 6 (clasificate anterior ca 7, 8, 9 si 11) nu pot fi deosebite de genotipul 1 doar prin analiza regiunii 5’UTR. Acuratetea identificarii subtipurilor 1a si 1b prin analiza regiunii 5’UTR este cuprinsa intre 80% si 95% si depinde de izolatele specifice testate³. Testul nostru utilizeaza secvente ale regiunii core in asociere cu regiunea 5’UTR pentru identificarea genotipului 6, subtipurile c-l. Pentru a perfectiona acuratetea identificarii subtipurilor 1a si 1b sunt incluse secvente aditionale ale genei core⁵.

Pregatire pacient – nu este necesara o pregatire speciala⁵.

Specimen recoltat – sange venos⁵.

Recipient de recoltare – vacutainer ce contine EDTA ca anticoagulant⁵.

Cantitate recoltata – cat permite vacuumul⁵.

Cauze de respingere a probei – folosirea heparinei ca anticoagulant; probe coagulate sau hemolizate⁵.

Stabilitate proba – sangele EDTA este stabil 48h la 2-8ºC⁵.

Metoda – reactie de polimerizare in lant urmata de revers-hibridizare; produsul de amplificare biotinilat sufera un proces de hibridizare folosindu-se sonde oligonucleotidice specifice pentru regiunile 5’UTR si core ale diverselor genotipuri VHC fixate pe un strip de nitroceluloza; dupa etapa de hibridizare se adauga conjugatul (streptavidina marcata cu fosfataza alcalina) care se va atasa de hibridul biotinilat; substratul cromogen adaugat in final va reactiona cu complexul strepatvidina-fosfataza alcalina si va genera un precipitat violet maroniu care va fi vizualizat sub forma unor benzi pe strip; interpretarea rezultatelor se face cu ajutorului unui card⁵.

Limite si interferente

Efectuarea genotiparii HCV nu este recomandata pentru screening-ul sau confirmarea infectiei HCV. Testul este posibil numai in cazul existentei unei viremii C > 600 UI/mL.

In anumite cazuri se pot obtine rezultate neinterpretabile datorita heterogenitatii secventelor genomului HCV, infectiior mixte sau existentei (rare) de tulpini VHC recombinate⁵.

  

Bibliografie

1. AASLD Practice guidelines http:/www.aasld.org/pdffiles/Prac._Guide_Hep_C
2. Consensus Conference Treatment of hepatitis C. Maison de la Chimie, Paris, France, 27 – 28 february 2002. Agence Nationale d”Accreditation et d”Evaluation en Sante (ANAES).
3. Chen Z, Weck KE. Hepatitis C virus genotyping: interrogation of the 5’ untranslated region cannot accurately distinguish genotypes 1a and 1b. In J Clin Microbiol. 2002; 40: 3127 – 3134.
4. Ileana Constantinescu, Institutul Clinic Fundeni. Genotiparea virusurilor hepatitice in Romania. Simpozion iunie 2008, Tg. Mures: Rolul tehnicilor de biologie moleculara in elucidarea mecanismelor infectiei cu virusul hepatitic de tip C, precum si in descoperirea de noi markeri pentru fibroza si carcinomul hepatocelular asociate cu aceasta infectie.

. 5. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2009. Ref Type: Catalog.

6. Neaga Emil. Prevalenta genotipului 1 HCV in Romania. Simpozion iunie 2008, Tg. Mures: Rolul tehnicilor de biologie moleculara in elucidarea mecanismelor infectiei cu virusul hepatitic de tip C, precum si in descoperirea de noi markeri pentru fibroza si carcinomul hepatocelular asociate cu acasta infectie.
7. Nguyen MH, Keeffe EB. Prevalence and treatment of hepatitis C virus genotypes 4,5 and 6. In Clin Gastroenterol Hepatol. 2005; 10: S97 – S101.
8. Pawlotsky JM. Hepatitis C virus genetic variability: pathogenic and clinical implications. In Clin Liver Dis. 2003; 7; 45 – 66.
9. Seeff LB, Hoofnagle JH Appendix: The National Institute of Health Consensus Development Conference : Management of Hepatitis C 2002. In Clin Liver Dis. 2003; 7: 261 – 287.
10. Simmonds P, Bukh J, Combet C et al. Consensus proposals for a unified system of nomenclature of hepatitis C virus genotypes. In Hepatol. 2005; 42; 962 – 973.
11. Stumpf M.P.H., Pybus O.G. Genetic diversity and models of viral evolution for the hepatitis C virus. In FEMS Microbiology Letters 214 (2002) 143-152