Virus herpetic uman (HHV) tip 8 ADN (in sange, LCR)

Laborator Synevo

Informatii generale

Virusul herpetic uman tip 8 – Human herpesvirus 8 (HHV-8) – a fost izolat in 1994 de catre Chang, Moore si colaboratorii, in urma analizei PCR a leziunilor din sarcomul Kaposi, fiind numit initial herpes virus asociat sarcomului Kaposi (KSHV). HHV-8 este singurul rhadinovirus uman (gamma-2 herpesvirus) cunoscut si este implicat in etiologia sarcomului Kaposi, bolii Castleman multicentrice si PEL (primary effusion lymphoma = limfom primar cavitar)².

KSHV este un virus ADN dublu catenar, invelit de o nucleocapsida, inconjurata de un tegument amorf si inchise de o anvelopa ce prezinta proiectii scurte. ADN-ul viral, initial liniar, devine circular spontan, imediat dupa decapsidare in nucleii celulelor infectate.  Genomul HHV-8 de ~ 165 kb contine aproximativ 100 de cadre deschise de citire (ORFs) aranjate intr-o regiune lunga unica flancata de mai multe unitati repetitive (de 0.8 kb) cu continut ridicat in citozina si guanina. Regiunea lunga contine secvente de gene conservate gasite in cele mai multe herpesvirusuri, intercalate cu secvente specifice pentru HHV-8. De asemenea un numar de gene KSHV prezinta omologie cu unele gene umane. Aceasta se datoreaza probabil faptului ca virusul, de-a lungul evolutiei sale, a „piratat” numeroase gene din celulele gazda: gene care codifica proteina de legare a complementului (ORF 4), citokine IL6-like (ORF K2), chemokine (ORF K4, ORF K4.1 si ORF K6), factorul antiapoptotic Bcl-2 (ORF 16), factorul de reglare a interferonului (ORF K9), ciclina D (ORF 72), proteina inhibitoare FLICE (ORF K13), molecule de adeziune celulara (ORF K14), receptorul cuplat cu proteine G (ORF 74), dihidrofolat reductaza, timidin kinaza, timidilat sintetaza, ADN-polimeraza. Studii functionale sugereaza ca aceste gene piratate ar putea ajuta virusul sa se sustraga raspunsului imun, sa previna oprirea ciclului celular si sa intrerupa activarea cailor apoptotice. Aceasta strategie a fost denumita “piraterie moleculara”^1;2;5.

Dupa infectie, virusul patrunde la nivelul  limfocitelor si ramane intr-o stare latenta. In  aceasta perioada genomul viral devine circular prin fuziune cap-coada si persista sub forma unui episom extracromozomial (plasmida) aflat in copii multiple (10 – 50 copii) in interiorul nucleului. Doar ~ 5 gene sunt activate in cursul infectiei latente, avand rolul de a promova supravietuirea celulara si tumorigeneza. Gena care codifica antigenul nuclear asociat cu latenta (LANA sau ORF 73) asigura replicarea ADN-ului viral si legarea episomilor la cromozomi in timpul mitozei. Ciclina D virala (ORF 72) stimuleaza trecerea din stadiul G1 in S, este rezistenta la numerosi factori inhibitori si determina diviziunea necontrolata a celulelor. FLICE activeaza factorul nuclear kappa B si inhiba apoptoza²

In cazul in care virusul se reactiveaza si intra in starea litica, incepe replicarea virala a episomului, sub forma de molecule ADN liniare (fiecare unitate genomica este taiata la nivelul regiunii terminale repetitive), care sunt asamblate in particule virale, ce sunt ulterior eliminate din celula, cu rolul de a infecta celule noi sau de a fi transmise la o noua gazda. In timpul replicarii litice, o singura celula poate produce mii de particule virale, care de obicei determina si moartea acesteia^1;2.

Spre deosebire de celelalte herpesvirusuri, HHV-8 nu induce infectii cu caracter ubicuitar, acestea fiind limitate in populatia generala. Persoanele din Africa sub-sahariana prezinta rata cea mai mare a infectiei (~50% din populatie). Seroprevalenta in regiunea mediteraneana este de ~10%, desi in anumite zone din Italia poate atinge 30%. In SUA prevalenta anticorpilor specifici este de 5%, in timp ce in Japonia de numai 0.2%. Exista mai multe modalitati de transmitere a infectiei: contact sexual (in special la homosexuali), prin saliva persoanelor infectate, transfuzii de sange, transplant de organe solide de la donatori seropozitivi^2;4.

Infectia primara cu HHV-8

Identificarea infectiei primare cu HHV-8 este dificila din cauza incidentei scazute a infectiei in cele mai multe populatii studiate si din cauza lipsei de trasaturi specifice care sa defineasca boala. Cele mai multe infectii sunt asimptomatice sau prezinta manifestari nespecifice, cum ar fi: febra, diaree, astenie, rinoree, eruptii cutanate localizate, limfadenopatie sau artralgii. Intr-un studiu clinic efectuat recent, 2 dintre pacientii care au suferit transplant renal au dezvoltat la 4 luni de la interventie o infectie primara cu HHV-8 de la acelasi donator pozitiv (un pacient a prezentat sindrom Kaposi diseminat, iar celalalt sindrom febril, splenomegalie, citopenie si aplazie medulara cu plasmocitoza). Desi exista putine studii in acest sens, se pare ca infectiile primare pot fi letale in contextul imunosupresiei, in timp ce la persoanele sanatoase infectia este autolimitanta².

Sarcomul Kaposi (SK) a fost descris pentru prima data in 1872 de catre dermatologul ungur Moritz Kaposi, ca fiind o tumora agresiva ce afecteaza pacientii tineri.

La indivizii sanatosi nu s-a decelat HHV-8, insa virusul a fost izolat la 52% din bolnavii SIDA cu SK si la 8 % din cei fara SK. S-a aratat ca peste 55% din bolnavii infectati HIV la care s-a izolat HHV-8 au sau vor face SK in urmatoarele luni¹.

SK este endemic in Africa ecuatoriala sub-sahariana, reprezentand 10-17% din totalul tumorilor maligne ale adultilor. In alta regiuni ale globului SK este rar, fiind decelat la persoane adulte din bazinul mediteranean si Europa de Est. In Statele Unite SK afecteaza in primul rand pacientii cu SIDA.

Sarcomul Kaposi este o tumora vasculara, ce apare la nivelul tegumentului, mucoaselor si viscerelor, cu evolutie ce merge de la forme indolente, cu afectare minima a tegumentului sau ganglionilor limfatici, pana la forme fulminante, cu manifestari viscerale si cutanate extensive. Un diagnostic de sarcom Kaposi se bazeaza pe biopsia din leziunea suspecta. Histologic se observa  proliferarea celulelor fusiforme endoteliale si extravazarea eritrocitelor. In cazurile depistate precoce pot fi observate macrofage incarcate cu hemosiderina si celule inflamatorii^2;5.

Clinic, sarcomul Kaposi se prezinta sub 4 forme: clasic, asociat cu SIDA, asociat cu afectiuni ce determina imunosupresie si endemic.

Sarcomul Kaposi clasic apare mai ales la pacientii varstnici din regiunea mediteraneana si Europa de Est; leziunile se gasesc la nivelul extremitatilor si au o evolutie lenta.

Forma endemica a sarcomului Kaposi se intalneste mai frecvent in Africa, predominant la barbati (barbati:femei = 20:1) si copii HIV negativi. Din punct de vedere clinic, se aseamana cu forma clasica, dar aparitia bolii la copiii sub varsta de 10 ani are o evolutie agresiva, adeseori fatala.

Sarcomul Kaposi asociat cu SIDA apare la pacientii cu infectie HIV si reprezinta forma cea mai agresiva clinic a sarcomului. Poate aparea in orice stadiu al infectiei HIV, chiar cu valori normale ale limfocitelor T CD4+. Morbiditatea si mortalitatea apar prin afectare cutanata (leziunile sunt mai frecvente la nivelul fetei), gastrointestinala sau pulmonara extinsa. La pacientii cu terapie HAART boala are o evolutie mai lenta sau poate regresa spontan^1;2;5.

Sarcomul Kaposi iatrogen apare la persoanele imunocompromise dupa transplant de organe sau la cei care primesc terapie imunosupresiva, incidenta sa fiind mai crescuta la persoanele cu transplant renal decat alte tipuri de imunosupresie (incidenta de pana la 5%). Transmiterea infectiei HHV-8 prin intermediul organelor transplantate de la donatori seropozitivi constituie un factor de risc pentru dezvoltarea SK asociat cu transplantul. Reducerea terapiei imunosupresoare determina remisia sarcomului Kaposi^1;2;4.

Limfomul asociat cu HHV-8 (PEL) a fost descris pentru prima data in 1989 la pacienti infectati cu HIV, ca o categorie speciala de limfoame ce se dezvolta la nivelul cavitatilor seroase (pleura, pericard, peritoneu). Este o afectiune rara ce este responsabila de 3% din limfoamele asociate cu HIV si 0.4% din limfoamele non-Hodgkin cu celule mari ale persoanelor HIV negative.

Are o morfologie distincta comparabila cu limfomul imunoblastic si cu limfomul anaplazic cu celule mari si apare frecvent la barbati. Se prezinta ca un revarsat limfomatos ce ramane localizat la nivelul cavitatii de origine. Celulele maligne exprima imunoglobuline clonale si CD45 pe suprafata indicand originea in limfocitele B, desi antigenele specifice celulei lipsesc. Celulele tumorale infectate cu HHV-8 sunt frecvent coinfectate cu virusul Epstein-Barr.

Prognosticul este rezervat, decesul producandu-se in cateva luni de la diagnostic^1;2.

Boala Castleman este o afectiune limfoproliferativa rara, descrisa in 1956, ce se prezinta sub 2 forme: localizata si multicentrica. Forma localizata nu este asociata cu HHV-8. Virusul este asociat aproape intotdeauna (80%) cu boala Castleman la pacientii HIV pozitivi si in circa 50% cazuri la persoanele HIV negative. Celulele infectate cu HHV-8 sunt localizate in zona de manta a foliculului limfatic de la nivelul ganglionilor. IL-6, interleukina care determina diferentierea limfocitelor B in plasmocite, se gaseste in concentratii crescute in centrul germinativ al foliculului limfatic, explicand numarul mare de plasmocite in ser.

Forma multicentrica se asociaza cu febra, hepatosplenomegalie si limfadenopatie generalizata, are o evolutie agresiva, frecvent fatala.

Diagnosticul pozitiv al unei infectii cu HHV-8 poate fi demonstrat prin detectarea ADN-ului viral in plasma sau in celulele mononucleare din sangele periferic.

Recomandari pentru determinarea HHV-8 ADN – utilitate in diagnosticul infectiilor cu HHV-8³.

Pregatire pacient – nu este necesara³.

Specimen recoltat – sange venos³.

Recipient de recoltare – vacutainer ce contine EDTA ca anticoagulant³.

Cantitate recoltata – cat permite vacuumul³.

Prelucrare necesara dupa recoltare – proba nu va fi centrifugata³.

Cauze de respingere a probei – probe vechi, coagulate, hemolizate; folosirea heparinei ca anticoagulant³.

Stabilitate proba – probele de sange sunt stabile 48 ore la 2-4°C inainte de extractia acizilor nucleici³.

Metoda – Real-time PCR Light-Cycler: reactie de polimerizare in lant cu detectie in timp real a produsului PCR  acumulat, prin masurarea fluorescentei emise³.

Valori de referinta – HHV-8 ADN nedetectabil³.

Limita de detectie – 10 copii/proba³.

Interpretarea rezultatelor

Detectarea HHV-8 ADN in celulele mononucleare din sangele periferic la pacientii HIV pozitivi fara sarcom Kaposi este predictiva pentru dezvoltarea leziunilor ulterioare.

Viremia HHV-8 este mai mare la persoanele cu forme avansate de sarcom comparativ cu stadii incipiente si, de asemenea, valori ridicate se inregistreaza la formele asociate cu HIV fata de cele clasice. Incarcatura virala din celulele mononucleare din sangele periferic este mai mica la bolnavii cu sarcom in remisie fata de cei cu boala activa. Desi exista corelatie intre viremie si activitatea bolii, folosirea acesteia pentru monitorizarea evolutiei si tratamentului sarcomului Kaposi este limitata deoarece concentratiile plasmatice sunt prea mici.

Pacientii cu limfom au un nivel al viremiei mai ridicat decat cei cu sarcom Kaposi, dar mai scazut decat cei cu boala Castleman.

Incarcarea virala atat in plasma, cat si in celulele mononucleare din sangele periferic este la un nivel suficient de ridicat pentru ca viremia sa fie folosita in monitorizarea evolutiei si tratamentului bolii Castleman. Faza activa a bolii se asociaza cu valori crescute ale viremiei, spre deosebire de stadiul de remisiune caracterizat de nivele scazute de ADN HHV-8^1;2.

Bibliografie

1. Daniel C Edelman. Human herpesvirus 8 – A novel human pathogen. In Virology Journal, 2005, 2:78.
2. Kenneth M. Kaye. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Tzpe 8. In Mandell, Douglas,and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th edition, Churchill Livingstone, Elsevier, 2010, 2017-2021.
3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.
4. Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories Test Catalogs and Guides. Human Herpesvirus-8 Antibody, IgG, Serum. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
5. Victoria Arama,. Madelena I. Dragan. Infectii cu virusuri herpetice. In Boli infectioase pentru studentii facultatilor de Stomatologie, UMF Bucuresti, 1998.