Profil miozita – Blot

Analize medicale

Laborator Synevo

 

Informaţii generale şi recomandari pentru determinarea profilului miozita

Miopatiile inflamatorii idiopatice reprezinta un  grup de afectiuni caracterizate prin slabiciunea musculaturii proximale a membrelor, atrofie musculara, semne biochimice  şi electromiografice de leziune musculara, anomalii histologice, modificari cutanate caracteristice. Apar cu o incidenta de 0,1-1/100 000 locuitori/an şi sunt mai  frecvente la femei. Din acest grup fac parte: polimiozita, dermatomiozita, miozita cu corpi de incluziune, miozita asociată cu neoplazie (sindrom paraneoplazic) şi miozita asociată cu alte boli ale tesutului conjunctiv6;7.

Din punct de vedere histologic miozita poate fi diferenţiata in miozita interstitiala fara distructia fibrei musculare, miozita focala cu infiltrat inflamator si leziuni ale fibrei musculare si miozita difuza.

Polimiozita (PM)  se caracterizează clinic prin febra, slabiciune musculara, artralgii, posibil sindrom Raynaud.

In dermatomiozita (DM)  pacientii prezinta eritem violaceu periorbital asociat sau nu cu edem, eritem care se poate extinde ulterior pe brate, maini si membre inferioare.

Testele de laborator evidentiaza cresterea enzimelor musculare (CK, AST, LDH) si pozitivitatea marker-ilor de inflamatie (CRP, VSH).

Ca si in cazul sclerozei sistemice, autoanticorpii specifici joaca un rol major in diagnosticul si clasificarea diferitelor variante ale acestor afectiuni (incluzand si sindroamele overlap), cu atat mai mult cu cat prevalenta anticorpilor antinucleari este marcat scazuta (40-60%) comparativ cu lupusul eritematos sistemic. Acesti autoanticorpi recunosc tinte antigenice multiple: tipuri de ARN de transfer (ARNt), aminoacil-t-ARN-sintetaze, componente ale particulei de recunoaştere a semnalului (“signal recognition particle”, SRP), factori translationali, componente ale complexului de remodelare a nucleozomului, insa cei mai importanti sunt cei directionati impotriva aminoacil-t-ARN-sintetazelor (familie de enzime care se gaseste in toate celulele nucleate si care are rolul de a atasa un anumit aminoacid de ARNt-ul propriu). Prezenta autoanticorpilor se asociaza cu anumite subseturi de boala, avand valoare predictiva pentru diferite manifestari clinice si pentru prognosticul bolii1;2;6;7.

Anticorpii anti-Jo-1 sunt indreptati impotriva enzimei histidil-t-ARN sintetaza. In vitro aceşti autoanticorpi se leaga de epitopii conformationali ai enzimei si ii inhibă activitatea catalitica. Antigenul este sub forma dimerica şi este localizat  în citoplasma; masa moleculara a subunitatilor este 50 kDa. Prevalenta anticorpilor anti-Jo-1 in polimiozita si dermatomiozita este de 20-40%; autoanticorpii pot fi detectati precoce, uneori precedand debutul simptomelor. La copii anticorpii anti-Jo-1 sunt extrem de rari. Pacientii cu anticorpi anti-Jo-1 prezinta o triada tipica de simptome: polimiozita (>90%), polisinovita (artralgii, artrita deformanta noneroziva, tenosinovita in 50% din cazuri), alveolita fibrozanta sau fibroza pulmonara (60%). Se mai pot adauga: fenomen Raynaud (40%), febră (20%), “mana mecanicului” (30%). Acest tablou este cunoscut sub numele de sindrom anti-sintetaza. Mai mult de 90% din pacientii caucazieni cu anti-Jo-1 prezinta alela HLA DR31;4;6;7.

Desi anticorpii directionati asupra altor aminoacil-t-ARN-sintetaze: anti-PL-7 (anti-treonil-t-ARN-sinteza), anti-PL-12 (anti-alanil-t-ARN-sintetaza), anti-EJ(anti-glicil-t-ARN-sintetaza) şi anti-OJ (anti-leucil-t-ARN-sintetaza) sunt mult mai putin frecventi decat anti-Jo-1, acestia sunt asociati cu aceleasi manifestari clinice compatibile cu sindromul anti-sintetaza6. De obicei un pacient prezinta un singur tip de anticorpi anti-sintetaza, dar au fost descrise si cazuri in care au fost depistati toti cei 5 autoanticorpi. Sindromul anti-sintetaza raspunde moderat la terapia cortizonica. Deoarece toate sintetazele se gasesc in citoplasma (sediul sintezei proteice), autoanticorpii determina un aspect fin  citoplasmatic  in imunofluorescenta indirecta ce foloseste ca substrat celulele Hep-21.

Anti-PL-7 apar cu o prevalenta de 3-6% la pacienti cu miozita, mai ales in sindroame overlap (LES, scleroza sistemica, fibroza pulmonara interstitiala).

Anti-PL12 sunt detectati cu o prevalenta de 3% la pacienti cu miozita.

Anti-EJ  si anti-OJ apar in polimiozita dar si in sindroame overlap3.

Anticorpii anti-Mi-2 sunt indreptati impotriva helicazei nucleare (complex proteic nuclear implicat in reglarea transcriptiei); apar la 15-30% dintre pacientii cu dermatomiozita  (avand specificitate mare pentru aceasta afectiune) si rar la pacienti cu polimiozita. Cei mai multi dintre pacientii cu anticorpi anti-Mi-2 sunt purtatori ai alelei HLA DR7. Forma de boala este benigna, cu raspuns bun la terapia cortizonica6;7.

Anticorpii anti-Ku sunt indreptati impotriva unui antigen proteic nucleolar de tip heterodimer, compus din doua subunitati cu masa moleculara de 70 si respectiv 80 kDa, component al unui complex enzimatic al proteinkinazei dependente de ADN. Acest complex detine un rol important in procese celulare legate de translatie, repararea ADN-ului si rearanjarea genelor implicate in sinteza imunoglobulinelor, precum si a receptorilor celulelor T.  Anticorpii anti-Ku sunt intalniti intr-un spectru larg de boli ale tesutului conjunctiv, in special sindroame overlap sclerodermie-miozita, dar si LES (3-10%). Aspectul in imunofluorescenta indirecta este de tip granular (patat); de asemenea a fost descrisa o asociere cu alela HLA DQw1. Prevalenta anticorpilor anti-Ku in afectiunile autoimune este variabila, originea etnica fiind un element important. Spre exemplu, in America de Nord si Europa au fost descrise cazuri de LES asociati cu anticorpi anti-Ku, dar nu si in Japonia. Sindromul Sjögren primar, ca si hipertensiunea pulmonara primitiva constituie alte conditii clinice frecvent asociate cu anti-Ku.

Anticorpii anti PM-Scl sunt indreptati impotriva complexului nucleolar compus din 11-16 polipeptide, a caror functie nu a fost inca determinata6. Anticorpii sunt detectati in peste 90% din cazurile de sindrom overlap  sclerodermie-polimiozita (sclerodermatomiozita), dar numai la ~8% din toate cazurile de miozită si ~3% din toate cazurile de sclerodermie5. Prognosticul este relativ favorabil la acest grup de pacienti. Se asociaza cu HLA DR3 si anticorpi anti-nucleari cu aspect nucleolar omogen in imunofluorescenta2;6. In laborator se detecteaza separat cei doi autoanticorpi principali: anti PM-Scl100 si anti PM-Scl753.

Anti-SRP (“signal recognition particle”) reactioneaza cu un component de 54 kDa al complexului SRP care are rolul de a media transportul de proteine nou sintetizate spre reticulul endoplasmatic. Au fost descrisi la pacienti cu polimiozita si dermatomiozita (pana la 4% din cazuri), in special la femei de rasa neagra. Anti-SRP sunt markeri pentru miopatia necrozanta  caracterizata prin slabiciune acuta severa proximala si simetrica a musculaturii scheletice asociata cu durere musculara; este afectata si musculatura cardiaca. Boala se asociaza cu rata de mortalitate crescuta si raspuns slab la terapia cortizonica6;7.

Anti-Ro52 sunt indreptati impotriva unui antigen de 52kDa si au fost descrisi ca autoanticorpi nespecifici asociati cu boli reumatice si non-reumatice. Sunt prezenti intr-un procent de 100% la mamele fetilor sau nou-nascutilor cu bloc atrio-ventricular congenital sau lupus neonatal6. Un anumit procent de pacienti cu polimiozita/dermatomiozita prezinta Anti-Ro52 in asociere cu anticorpii anti-aminoacil-t-ARN-sintetaza (in special anti-Jo-1)1;2.

Pregatire pacient – à jeun (pe nemancate) sau postprandial (dupa mese)3.

Specimen recoltat  sange venos3.

Recipient de recoltare – vacutainer fara anticoagulant cu/fara gel separator3.

Prelucrare necesara dupa recoltare – se separa serul prin centrifugare3.

Volum proba – minim 1 mL ser3.

Cauze de respingere a probei

  • specimen hemolizat;
  • specimen icteric, lipemic;
  • specimen contaminat bacterian3.

Stabilitate proba  serul separat este stabil 14 zile la 2-8ºC si timp indelungat la -20ºC. Nu decongelati/recongelati3.

Metoda – imunoblot. Antigenele utilizate sunt native (Jo-1)  si recombinate.

Strip-urile sunt alcatuite din cip-uri membranare fixate  cu diverse antigene purificate: Mi-2, Ku, PM-Scl 100, PM-Scl 75, Jo-1, SRP, PL-7, PL-12, EJ, OJ, Ro-52.

Intr-o prima etapa strip-ul incarcat cu antigenele purificate este incubat impreuna cu serul diluat al pacientului. Daca in ser sunt prezenti anticorpi specifici acestia se vor lega de antigenele corespunzatoare de pe strip. Dupa o etapa de spalare, strip-ul este incubat cu un conjugat anti-IgG uman marcat cu fosfataza alcalina. Conjugatul se va atasa la porţiunea IgG a complexului antigen-anticorp. Dupa indepartarea prin spalare a conjugatului nelegat se adauga soluţia de colorare (substratul enzimei) – un sistem de detectie enzimatica colorimetrica . Daca este prezent conjugatul legat reactia enzimatica va genera un produs colorat albastru-inchis la nivelul benzilor ocupate de anticorpi specifici. Astfel, benzile vizualizate la nivelul stripului sunt rezultatul legarii  anticorpilor specifici de antigenele individuale de la nivelul strip-ului.

Pe fiecare strip  există o banda de control intern. Aparitia unei reactii de culoare intense la acest nivel certifica faptul ca toate etapele testului imunoblot au fost executate corect3.

Interpretarea definitiva a rezultatelor testului se face cu ajutorul unui software (după scanarea strip-urilor) care in functie de intensitatea semnalului, acorda un punctaj pentru fiecare banda a strip-ului, astfel:

EVALUARE SEMNAL

INTENSITATE  SEMNAL

REZULTAT

Fara  banda

                  0-5

               0     

Fara  banda

Banda slaba

                 6-10   

             (+)

Banda slaba

Banda medie-intensa

   11-25 sau 26-50

           +,++

Banda medie-intensa

Banda foarte intensa

              >50

           +++

Banda foarte intensa

In final este calculata suma  punctelor acordate si se va genera rezultatul testului.

Un rezultat pozitiv confirma prezenta anticorpilor specifici .

Un rezultat echivoc indica faptul ca prezenta auto- anticorpilor este incerta; in functie de contextul clinic al pacientului testul va fi repetat la un interval de 1-2 luni.

Un rezultat negativ indică absenta auto-anticorpilor specifici.

Valori de referinta  

Anti-Mi-2: negativ

Anti-Ku: negativ

Anti-PM-Scl100: negativ

Anti-PM-Scl75:negativ

Anti-Jo-1: negativ

Anti-SRP: negativ

Anti-PL-7: negativ

Anti-PL-12: negativ

Anti-EJ: negativ

Anti-OJ: negativ

Anti-Ro-52: negativ3.

Interpretarea rezultatelor

          Identificarea anticorpilor anti-aminoacil-tARN-sintetaze se asociază puternic cu sindromul anti-sintetaza. Asocierea miozitei cu autoanticorpi anti-SRP defineste o forma severa de polimiozita cu manifestari cardiovasculare si rata crescuta a mortalitatii. Prezenta anticorpilor anti-Mi-2 defineste dermatomiozita clasica cu rash cutanat, eritem periunghial si raspuns bun la terapia cortizonica. Anticorpii mentionati reprezinta autoanticorpi specifici miozitei7.

Doua studii clinice recente au furnizat următoarele date privind prevalenta si specificitatea autoanticorpilor depistati prin tehnica imunoblot la pacienti cu miozita3:

STUDIUL 1

STUDIUL 2

Anti-

Prevalenta

Specificitate

Anti-

Prevalenta

Specificitate

Mi-2

3%

100%

Mi-2

4%

98%

Ku

3%

97%

Ku

5%

95%

Pm-Scl100

7%

100%

Pm-Scl100

4%

100%

Jo-1

12%

100%

Jo-1

21%

100%

PL-7

2%

100%

PL-7 sau PL-12

4%

100%

PL-12

0%

100%

 

 

 

Limite si interferente

Anticorpii anti-PM-Scl, anti-Ku si anti-Ro52 sunt considerati autoanticorpi asociati miozitei care, fiind lipsiti de specificitate, se intalnesc si in alte afectiuni ale tesutului conjunctiv3;7.

Bibliografie 

  1.  Athanasios G. Tzioufas. Antisynthetase Syndrome. In Orphanet Encyclopedia, Nov. 2001. Ref Type: Internet Communication.
  2. Carlos Albertos von Mühlen, Robert M. Nakamura. Clinical and Laboratory Evaluation of Systemic Rheumatic Diseases. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Saunders Elsevier, 21st Edition, 8, 919, 923.
  1. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2012. Ref Type: Catalog.
  2. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: Jo 1 Antibodies, IgG, Serum. www.mayomedicallaboratories.com.

         Ref Type: Internet Communication.

  1. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: PM-Scl Antibody. www.mayomedicallaboratories.com.

         Ref Type: Internet Communication.

  1.   Rudolf Mierau, Ekkehard Genth. Autoantibodies in Systemic Rheumatic Diseases. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. Lothar Thomas. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany,1 ed.1998, 831-832.
  1.    Ruxandra Ionescu. Boli inflamatoare musculare. În Esenţialul în Reumatologie, Editura Amaltea, 2007, 399-408.

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată. Câmpurile obligatorii sunt marcate cu *