Imunofenotipare limfocitara-profil de baza

Laborator Synevo

Informatii generale despre sistemul imun

Functia primara a sistemului imun este aceea de a lupta impotriva agentilor patogeni microbieni (bacterii, paraziti, fungi, virusuri). Sistemul imun indeplineste aceasta functie in doua moduri: in primul rand, prin generarea unui raspuns imun specific impotriva agentului patogen invadant si controlul infectiei; si in al doilea rand, prin reamintirea acestui prim “conflict” si declansarea unui raspuns imun accelerat in urma reexpunerii la acelasi agent patogen microbian³.

Sistemul imun este constituit dintr-o retea complexa de celule, tesuturi si organe care participa impreuna la apararea organismului uman.

Cunoasterea structurii si functiei complexe a sistemului imun ajuta la intelegerea fundamentului deficientelor immune congenitale sau dobandite (infectia HIV) si la perceperea cailor potentiale prin care sistemul imun poate fi modulat in cazul unor boli specifice^3;9.

Organele limfoide ale sistemului imun sunt: maduva osoasa hematogena (situsul hematopoiezei), timusul (centrul “instructajului timic”, de maturare a protimocitelor in celule T mature), splina („filtrul” imunologic al sangelui), nodulii limfatici (centrul imunologic al limfei), tesutul limfoid asociat mucoaselor (MALT) si tesutul limfoid asociat tractului digestiv (GALT)^9;11. Intr-o maniera similara, macrofagele si celulele dendritice de la nivelul splinei si nodulilor limfatici captureaza antigenele si le prezinta limfocitelor B si T, declansand astfel raspunsul imun.

Celulele sistemului imun sunt: limfocitele T, limfocitele B, celulele NK, granulocitele, macrofagele/monocitele, fibrobastii, celulele epiteliale, celulele dendritice^3;9.

Majoritatea agentilor patogeni au o capacitate de proliferare foarte ridicata, iar prevenirea infectiilor sistemice necesita raspunsuri adecvate si rapide din partea sistemului imun innascut si a sistemului imun dobandit¹¹.

Imunitatea nespecifica/innascuta asigura prima linie de aparare impotriva agentilor microbieni patogeni¹¹.

Se caracterizeaza prin raspunsuri imune nespecifice, rapide si la fel de intense, indiferent de tipul agentului patogen, care destul de rar sunt suficiente pentru a elimina in totalitate infectiile microbiene celulare si prin lipsa memoriei imunologice sau a unei imunitati protective de durata. Este asigurata prin intermediul barierelor anatomice (tegumente, membrane, mucoase), barierelor fiziologice (temperatura, pH), factorilor chimici (interferoni, sistemul complement), celulelor cu activitate fagocitara (macrofage/monocite, celule dendritice, neutrofile, fibroblasti, celule epiteliale), citotoxicitatii mediate celular (celulele NK)^3;9.

Prin productia de mediatori (citokine, chemokine, interferoni), raspunsurile imune nespecifice stabilesc “scena“ pentru declansarea raspunsurilor imune specifice¹¹.

Imunitatea specifica/dobandita/adaptativa este acea functie a sistemului imun de a recunoaste specific antigenele si de a dezvolta oimunitate mediata umoral, o imunitate mediata celular sau ambele, principalii “ jucatori” fiind anticorpii, limfocitele B, limfocitele T si celulele prezentatoare de antigen. Acest tip de imunitate poate fi dobandita activ (organismul gazda produce propriile anticorpi/limfocite imunologic active, iar imunitatea este de lunga durata) sau pasiv (organismul primeste anticorpi/limfocite imunologic active produse in timpul unui raspuns imunologic activ in alt organism, iar imunitatea este de scurta durata). Indiferent ca este vorba despre o imunitate activa sau pasiva, aceasta poate fi dobandita natural (anticorpii sunt produsi in organismul gazda sau primiti prin transfer placentar/alaptare) sau artificial (prin vaccinare)⁹.

O carateristica importanta a acestui tip de imunitate este memoria imunologica.

Raspunsurile imune adaptative sunt larg extinse prin stimulare antigenica, ceea ce conduce la expansiunea clonala, diferentierea si maturarea a diverse clone de celule B antigen specifice, pentru a produce anticorpi circulanti (raspuns imun umoral), si prin activarea celulelor T, derivate din timus, la raspunsuri imune celulare antigen specifice. Practic, imunitatea adaptativa depinde de reteaua de interactiuni foarte complexe si intricate dintre diferitele tipuri celulare si subseturile lor, reglate prin productia lor de mediatori (citokine, chemokine si interferoni tip I,II )¹¹.

Celulele sistemului imun innascut constituie o rezerva celulara uniforma fara specificitate antigenica; pot fi recrutate in numar remarcabil de mare; sunt primele care ajung la locul infectiei; modelul de migrare este unidirectional, iar odata exercitata functia lor, celulele vor fi eliminate. In cazul celulelor specifice sistemului imun dobandit (limfocitele), acestea sunt prezente intr-un numar scazut pentru un anumit antigen si, pentru a contrabalansa acest dezavantaj, ele urmeaza un mod complex de migrare, strans dependent de statusul lor de activare si memorie imunologica. Prezinta deci capacitatea de a recircula: reintra in circulatia sangvina de la nivelul tesuturilor limfoide si migreaza catre un situs la distanta. Migrarea limfocitelor este bine organizata pentru a asigura o expunere eficienta a acestora la antigenele lor inrudite de la nivelul organelor limfoide secundare. Mai mult, clonele limfocitare care prezinta anumite caracteristici relevante, cum ar fi receptorii care recunosc epitopii antigenici, nu sunt pierdute dupa implicarea in raspunsul imun, in schimb sunt rezervate ca “celule cu memorie” pentru a asigura raspunsuri imune specifice mai rapide si mai puternice, in cazul reinfectiei cu acelasi agent patogen¹¹.

Celulele prezentatoare de antigen (APC) reprezinta un grup de celule heterogen din punct de vedere morfologic si functional, provin din precursori medulari si sunt specializate in a prezenta antigenele limfocitelor, in special celulelor T. Aceste celule profesionale prezentatoare de antigen includ monocite (prezente in sangele periferic), macrofage (monocite tisulare), celule rezidente de la nivelul organelor limfoide ale sistemului imun (celule dendritice) si constituenti ai sistemului monocit-macrofag din alte organe solide. Limfocitele B, care capteaza antigenul prin intermediul receptorilor de tip mIg (imunoglobuline de membrana), pot de asemenea sa functioneze eficient ca APC pentru limfocitele T, prin prezentarea antigenului degradat (oligopeptid) legat de moleculele complexului major de histocompatibilitate (MHC); limfocitele T activate vor secreta citokine care vor dirija diferentierea limfocitelor B si productia de anticorpi a acestora. Caracteristica definitorie a acestor celule este exprimarea moleculelor MHC I si II pe suprafata lor, precum si a moleculelor accesorii necesare pentru activarea limfocitelor T: CD86 si CD80. Imediat dupa activare, APC pot sa secrete citokine care induc functii specifice in celulele carora le prezinta antigenul. Monocitele si macrofagele sunt fagocitic active, exercitand aceasta functie in special asupra antigenelor acoperite de anticorpi sau de componente ale sistemului complement care se leaga de receptorii de suprafata pentru Fcγ si C3b^11;12.

Moleculele de legare a antigenelor, prin capacitatea lor de a lega antigenele straine organismului uman, sunt responsabile de specificitatea raspunsului imun dobandit. Exista trei seturi de astfel de molecule: imunoglobuline (Ig), receptorul celulelor T (TCR) si moleculele MHC, toate aceste molecule facand parte din superfamilia de imunoglobuline (IgSF). Ig sunt alcatuite dintr-un lant polipetidic greu (H) si un lant usor (L), de tip kappa sau lambda; acestea sunt exprimate pe suprafata limfocitelor B si secretate ca anticorpi in cadrul raspunsului imun umoral. TCR se prezinta sub forma unui heterodimer alcatuit din 2 lanturi polipeptidice H – αβ/γδ; majoritatea limfocitelor T exprima αβ-TCR. Genele HLA situate pe cromozomul 6 codifica moleculele complexului major de histocompatibilitate MHC I si II. Moleculele MHC I sunt formate dintr-un singur lant H (HLA-A, B, C), spre deosebire de moleculele MHC II care sunt alcatuite din doua lanturi H – α si β (HLA-DQ, DR, DP). Limfocitele T care exprima pe suprafata lor receptori αβ-TCR pot fi divizate in doua subpopulatii majore. Aceasta impartire este bazata pe clasa de molecule MHC recunoscuta de receptorii αβ-TCR si de expresia moleculelor CD4 sau CD8, care prin atasarea de moleculele MCH contribuie la completarea legaturii moleculare intercelulare. In timp ce limfocitele CD4 recunosc antigenul legat de moleculele MHC I, limfocitele CD8 recunosc antigenul legat de moleculele MCH II; raportul limfocitelor CD4/CD8 in sangele periferic este aproximativ 2:1 (0.8:1-3:1). Toate celulele nucleate exprima molecule MHC I si sunt APC non-profesionale, APC profesionale exprimand molecule MHC II. Interactiunea dintre complexul MHC-peptidul antigenic si TCR detine un rol esential in protectia imuna, deoarece un raspuns imun complet necesita interventia celulelor T antigen specifice. Acesta reprezinta practic un mecanism de siguranta pentru a minimaliza posibila auto-reactivitate (reactivitate impotriva self-ului), astfel incat un limfocit T devine activat numai pentru ca a intalnit un antigen strain (non-self).

Limfocitele B provin din celulele stem hematopietice care, in mod succesiv, populeaza splahnopleura embrionara paraaortica, ficatul fetal si maduva osoasa hematogena. Celulele stem fiice dau nastere progenitorilor limfoizi multipotenti (PLM), care genereaza celulele mieloide sau limfoide. Astfel, PLM pot produce precursorii limfoizi comuni (PLC), iar acestia pot genera limfocitele T, limfocitele B, celulele NK si un subset special de celule dendritice. Diferentierea finala spre celulele B necesita ca celulele fiice PLC sa fie expuse unor micromedii specializate, asa cum sunt cele prezente in ficatul fetal si maduva osoasa. Trecerea de la ficatul fetal la maduva osoasa incepe la mijlocul vietii fetale si se termina chiar inainte de nastere; celulele B continua sa fie produse in maduva osoasa pe parcursul intregii vieti. Diferentierea celulelor B are loc in doua stadii, diferite din punct de vedere anatomic si functional; astfel, primul stadiu are loc in maduva osoasa si este antigen independent, iar cel de-al doilea stadiu are loc in organele limfoide periferice si este antigen dependent^9;11.

Limfocitele B imature, care exprima pe suprafata lor mIgM (imunoglobulina de membrana) si BCR (receptorul celulei B), parasesc maduva osoasa dupa un proces de selectie negativa a celulelor B auto-reactive si patrund in periferie (sange si organe limfoide secundare) unde isi completeaza diferentierea in celule B mature care exprima pe suprafata lor mIgM si mIgD si pot fi activate prin legarea de antigen¹¹.

Celulele B imature auto-reactive, ce exprima mIgM self-reactiv, urmeaza un proces cunoscut ca “receptor editing“, in care un rearanjament la nivelul genelor care codifica lantul greu al imunoglobulinelor (IgH) modifica specificitatea antigenica a receptorului. Daca acest proces esueaza, celulele B imature auto-reactive devin anergice sau vor suferi apoptoza in urma contactului cu antigenul. Aceasta contrasteaza cu abilitatea celulelor B mature de a deveni activate in urma contactului antigenic¹².

BCR este un complex format dintr-o mIg si doua molecule citoplasmatice Igα/CD79a si Igβ/CD79b. Cu ajutorul acestui receptor limfocitele B recunosc antigenul si devin astfel activate. Implicarea BCR initiaza o serie de evenimente care culmineaza cu diferentierea celulelor B in plasmocite capabile sa secrete imunoglobuline. Limfocitele B vor prezenta antigenul, recunoscut cu ajutorul BCR, limfocitelor T helper CD4 care au fost activate anterior de acelasi antigen,  limfocitele T helper fiind selectate din pool-ul de limfocite T naive de catre celulele dendritice prezentatoare de antigen. Acest proces de activare a limfocitelor B, dependent de limfocitele T, are loc prin interactiunea dintre CD40 de pe suprafata celulelor B si ligandul sau, CD145, de pe suprafata celulelor T helper si prin secretia de interleukina-4 (IL-4) de catre celulele helper. Ambele semnale servesc la promovarea si mentinerea activarii initiate de BCR¹¹.

La nivelul organelor limfoide secundare – in zonele bogate in celule T – celulele B naive, dupa stimularea antigenica, urmeaza o expansiune clonala si formeaza grupuri de celule B activate (focare extrafoliculare). Acestea se pot diferentia in plasmocite de scurta durata (secretoare de anticorpi cu afinitate joasa) sau migreaza inapoi in foliculi si initiaza formarea unui centru germinativ.

Dupa proliferare si maturatie, celulele B din centrul germinativ se pot diferentia in plasmocite de lunga durata si celule B de memorie. Majoritatea plasmocitelor de lunga durata migreaza in maduva osoasa si sunt raspunzatoare de mentinerea nivelului seric de anticorpi (anticorpi de inalta afinitate); celulele B de memorie pot ramane pentru o lunga perioada de timp la nivelul organelor limfoide secundare sau pot migra si habita in maduva osoasa^11;12. In urma contactului antigenic, celulele B de memorie raspund printr-o proliferare rapida si diferentiere in plasmocite, refacand astfel rezerva de celule B de memorie si plasmocite.

Prin dezvoltarea tehnologiei anticorpilor monoclonali, analiza anumitor molecule de pe suprafata celulelor B (CD = “cluster determinants”) a ajutat la definirea stadiilor care se succed pe parcursul intregului proces de diferentiere si maturatie a celulelor B (vezi tabelul 17.9.1.1):

	Celule Stem	Celule Pro-B	Celule Pre-B	Celule pre-Blate	Celule B imature	Celule B mature	Celule B activate	Plasmocite	Celule B de memorie
CD34	++	++
CD10		++	++	++	++	++
CD19		++	++	++	++	++	++	++	++
CD20		++	++	++	++	++	++	++	++
CD21		+	+	+	+	++	++	++
CD24		++	++	++	++	++	+	+
CD38		++	++				++	++	++
CD27								++	++

Tabel 17.9.1.1 Markeri pentru diferentierea celulelor B

Limfocitele T citotoxice (CTL) si celulele NK

Aceste doua tipuri celulare, distincte din punct de vedere fenotipic, dar strans legate prin functia lor citolitica (“killer”), sunt importante atat in controlul infectiilor, cat si in identificarea si eliminarea celulelor tumorale. Celulele CTL sunt limfocite T CD8+ care isi indeplinesc functia de “killer“ prin doua cai majore: liza mediata de perforine si granzime ce sunt eliberate din lizozomi si apoptoza receptor indusa (TNFR), ambele cai necesitand un contact apropriat intre celula litica si tinta sa, in special prin interactiunea dintre TCR si moleculele MHC I. Raspunsul CTL la o infectie acuta are loc in trei faze: prima consta in activarea initiala si proliferarea CTL; a doua in contractia celulelor T efectoare in celule T de memorie; iar a treia faza se refera la mentinerea de lunga durata a pool-ului de celule T de memorie. Celulele CTL se dezvolta la nivelului timusului, parasesc acest organ limfoid in stare naiva, circula intre organele limfoide secundare (splina si ganglionii limfatici) pe calea sistemului arterial, respectiv limfatic, si in cursul acestui pasaj intalnesc antigenul nonself. Antigenul este adus la nivelul organelor limfoide secundare prin sistemul limfatic de catre celula dendritica (APC); aceasta devine matura dupa achizitia antigenului nonself la nivelul tesuturilor non-limfoide. Desi celula dendritica este cel mai important APC profesional, macrofagele si celulele B sunt de asemenea capabile sa prezinte antigenul. Procesul infectios conduce la o crestere dramatica a CTL patogen/antigen specifice, iar magnitudinea acestui proces depinde de natura infectiei si de inoculul/doza de antigen. Aceasta expansiune este urmata de  contractia CTL efectoare in celule T de memorie. Un procent de 5% din populatia celulelor efectoare expansionate supravietuieste sub forma celulelor de memorie de lunga durata. Este prevenita astfel afectarea tisulara nespecifica ce se poate produce prin activitatea citolitica si eliberarea necontrolata de citokine si este asigurata flexibilitatea CTL de a raspunde la noi infectii.

Productia de celule de memorie antigen independenta de lunga durata este esentiala pentru un raspuns rapid in cazul unei reinfectii. CTL de memorie asigura un raspuns mult mai intens decat celulele CTL naive activate primar, atat din punct de vedere cantitativ cat si calitativ. Deoarece in cursul infectiei primare CTL sufera o expansiune clonala importanta, numarul de precursori CTL antigen specifici este mult mai mare la indivizii imunizati comparativ cu cei naivi, ceea ce permite un raspuns imun mai puternic. CTL de memorie prezinta o eficienta extraordinara in elaborarea functiilor efectoare prin productia rapida de gamma-interferon (IFNγ).

Compartimentul CTL de memorie este compus din doua tipuri celulare: CTL de memorie-efectoare (Tem) si CTL de memorie-centrale (Tcm), acestea din urma fiind capabile de o auto-reinnoire antigen-independenta homeostatica prelungita. La intalnirea cu antigenul, aceste celule dobandesc rapid functia efectoare si fenotipul celulelor Tem. Celulele CD4 si citokinele IL-15, IL-7, IL-2 si GM-CSF (factorul de stimulare al coloniilor pentru granulocite si monocite) au un rol important in supravietuirea si mentinerea rezervei de CTL de memorie (vezi tabelul 17.9.1.2).

In final, activitatea citotoxica a CTL are loc prin doua mecanisme:

• citolitic: dependent de productia de granzime (A, B) si perforine;
• non-citolitic: dependent de productia de citokine (IFNγ si TNF-α) care au capacitatea de a inhiba proliferarea agentilor patogeni intracelulari^11;12.

MARKER	CTL naive	Tem	Tcm
CD44	+	+++	+++
Distributiatisulara principala	Ganglioni limfatici, splina, sange	Tesuturile non-limfoide (plaman, ficat), splina	Ganglioni limfatici, splina, sange
Functia citotoxica	–	++	–
IFNγ	–	+++	+

 Tabel  17.9.1.2 Proprietatile CTL

Celulele NK apartin liniei celulare limfoide si sunt implicate in raspunsul imun innascut. In comparatie cu CTL, celulele NK sunt de talie relativ mare, granulare si nu necesita pre-activare pentru a recunoaste si a liza celule tumorale sau aberante. De asemenea nu au nevoie de prezenta moleculelor MHC I. Aceste celule sunt capabile sa produca cantitati importante de citokine si chemokine, care le permit sa moduleze raspunsul imun. IL-15 este necesara pentru a mentine nivelul homeostatic al celulelor NK in organism, activitatea de „killer” fiind exercitata in acelasi  mod ca si in cazul CTL.

Receptorii celulelor NK sunt clasificati in activatori si inhibitori si apartin la doua familii importante de receptori: killer cell immunoglobulin-like (KIR) si lectin-like. Prin receptorii inhibitori celulele NK recunosc moleculele MHC I de pe suprafata celulei tinta si primesc astfel un semnal inhibitor – no-killing; prin receptorii activatori recunosc liganzi celulari, virali sau indusi de stres, care transmit un semnal activator – pro-killing. In cazul in care o celula tinta nu exprima moleculele MHC I pentru a evita actiunea citolitica a CTL, aceasta va fi distrusa de catre celula NK.

Celulele NK se afla intr-un numar relativ redus la nivelul maduvei osoase si splinei (<2%) si reprezinta aproximativ 15% din numarul total de limfocite din sange. NK sunt de obicei definite prin intermediul unei combinatii de markeri de suprafata celulara (CD): CD3-, CD16+, CD56+. Astfel pot fi clasificate in doua subseturi, in functie de exprimarea CD16 si CD56:

• NKCD56dimCD16brightreprezinta >90% din NK din sangele periferic, exprima nivele mari de KIR si activitate citotoxica/citolitica mare (secretie crescuta de perforine/granzime);
• NKCD56brightCD16dimse caracterizeaza printr-o productie mai mare de citokine, potential proliferativ mai inalt si reprezinta principala populatie celulara NK de la nivelul organelor limfoide secundare^11;12.

Celulele T helper-CD4, in mod similar celulelor TCR+, se diferentiaza la nivelul timusului din celulele progenitoare comune limfoide, in cea mai mare parte in timpul vietii fetale si imediat dupa nastere. Initial, celulele T nu exprima TCR si sunt CD3-/CD4-/CD8- (triplu negative). Etapele de diferentiere timica includ stadiile:

• preTCR CD3+/CD4-/CD8- (dublu negative);
• TCR CD3+/CD4+/CD8+ (dublu pozitive);
• in ultima etapa, celulele T al caror TCR recunoaste antigenul prezentat de moleculele MHC II devin TCR CD3+/CD4+, iar cele al caror TCR recunoaste antigenul prezentat de moleculele MHC I devin TCR CD3+/CD8+.

Celulele T naive, pozitive pentru un singur CD (CD4 sau CD8) parasesc timusul si recircula din sange in ariile timus-dependente (TDA) ale organelor limfoide secundare. In majoritatea raspunsurilor imune, activarea celulelor T CD4+ are loc in TDA ale organelor limfoide secundare, iar celulele prezentatoare de antigen sunt reprezentate de celulele dendritice. Prezentarea eficienta a antigenului non-self stimuleaza activarea, proliferarea si diferentierea limfocitelor CD4+ in trei categorii functionale: celule CD4+ cu activitate  proinflamatorie, celule CD4+ cu activitate reglatoare/antiinflamatorie si celule CD4+ ce functioneaza ca celule de memorie. Diferentierea dintre celulele T naive, efectoare si de memorie se face baza moleculelor exprimate pe suprafata lor (vezi tabelul 17.9.1.3).

Celulele CD4+ efectoare sunt cele care sustin procesele inflamatorii prin eliberarea de citokine, fiind divizate in trei categorii: Th1 , Th2, Th17^11;12.

Celulele T reglatoare (Treg)

Pentru a preveni raspunsurile imune auto-distructive si a permite cele protective impotriva antigenelor non-self, sistemul imun a dezvoltat o serie de mecanisme reglatoare care au rolul de a inhiba generarea de limfocite T si B self-reactive potential daunatoare –toleranta imuna centrala – si de a scadea activarea celulara si expansiunea limfocitelor atunci cand acestea intalnesc antigene self –toleranta imuna periferica.

Au fost descrise mai multe tipuri de celule T cu activitate reglatoare: celule T TCRγδ +, celule NK, limfocite T CD8+ si limfocite T CD4+.

Celulele T CD4+ reg pot fi divizate in doua categorii: celulele Treg care apar natural (generate in timus) si celulele Treg induse (Treg 1 care secreta IL-10, Th3 care secreta TGFβ), diferentiate din celulele T naive. Celulele T CD4+ reg  derivate din timus sunt CD25+ si se gasesc intr-un procent de 30%, insa doar 2-4% din celule Treg CD25high+ au proprietati supresive. Un alt marker important este factorul de transcriptie FOXP3 care este exprimat in mod specific la nivelul celulele Treg timic derivate. Majoritatea celulelor FOXP3 + sunt celule CD4+CD25 bright+ si doar cateva sunt celule CD25- si CD25 low+¹¹.

Celulele T de memorie

Nivelul protectiei imune se coreleaza cu numarul de celule T de memorie antigen specifice. In cursul infectiei primare exista o expansiune importanta a rezervei de celule T CD4+ si celule T CD8+ specifice antigenului patogen. Numeroase studii demonstreaza faptul ca marimea rezervei de celule T de memorie depinde de marimea „exploziei” de celule T antigen specifice din timpul fazei de expansiune. Celulele T de memorie pot fi clasificate in: celule T centrale de memorie si celule T efectoare de memorie.

Trebuie retinut ca celulele T de memorie pot prolifera si produce citokine ca raspuns la o stimulare cu o cantitate mai mica de antigen, cu o costimulare mai slaba si mult mai rapid comparativ cu celulele T naive. In plus, ele pot promova si intensifica functia APC si accelera activitatea celulelor T naive.

In absenta stimularii antigenice, celule T de memorie pot suferi o proliferare homeostatica pentru a isi reface rezerva. Celulele T de memorie CD4+ si CD8+ isi pot pastra responsivitatea lor rapida in absenta stimulului antigenic si sunt capabile sa confere o imunitate protectiva^11;12.

MARKER	Celule T naive	Celule T efectoare	Celule T de memorie
CD62L	H	L	H/L
CCR7	H	L	H/L
CD45RA	H	L	H/L
CD45RO	L	H	L/H

Tabel 17.9.1.3  Markeri pentru diferentierea celulelor T

H = exprimare marcata; L= exprimare slaba                                                              

Profilul imun de baza si recomandari pentru efectuarea acestui test

In cadrul profilului de baza sunt determinate atat procentual cat si in valoare absoluta principalele subseturi de limfocite implicate in raspunsul imun, prin identificarea markerilor de suprafata specifici (moleculele CD):

-limfocitele totale (CD45+);

-limfocitele T (CD3+);

-limfocitele T helper (CD3+/CD4+);

-limfocitele T supresoare/citotoxice (CD3+/CD8+);

-raportul CD4+/CD8+;

-limfocitele T imature CD3+/CD8+/CD4+ ;

-limfocitele B (CD19+);

-celulele NK (CD3-/CD16+/CD56+).

Principala aplicatie a determinarii subclaselor limfocitare este screening-ul, evaluarea si monitorizarea deficientelor imune, caracterizate prin infectii recurente, unele amennintatoare de viata, ce pot fi bacteriene, virale si/sau fungice in functie de natura deficientei.

Imunodeficientele primare (congenitale) sunt afectiuni rar intalnite, cu o frecventa estimata la 1/10000 nasteri vii, in schimb mult mai frecvente sunt imunodeficientele secundare din boli maligne limfo-reticulare, boli autoimune, tratamente imunosupresoare, infectii virale, deficiente nutritionale, boli cu pierdere de proteine.

Deficientele imune celulare pot fi numerice sau functionale, putand fi implicate neutrofilele sau limfocitele. Pe baza hemogramei poate fi depistat un numar scazut al uneia din clasele de leucocite, insa numarul total de limfocite este inadecvat pentru investigarea unei deficiente imune, fiind necesara cuantificarea separata a principalelor subseturi limfocitare B, T si NK prin citometrie in flux.

Pentru identificarea deficitelor imune celulare functionale sunt disponibile teste functionale.

 Sunt descrise peste 200 tipuri de imunodeficientele primare, aproximativ 170 dintre ele avand defecte genetice identificate. Heterogenitatea clinica si imunologica a acestor afectiuni face ca diagnosticul sa fie dificil, necesitand corelarea datelor clinice si radiologice cu teste imunologice si genetice.

Imunofenotiparea limfocitara cu determinarea cantitativa a subseturilor de limfocite face parte dintr-un spectru complex de teste diagnostice ce pot fi efectuate prin citometrie in flux, cum ar fi identificarea unor proteine anormale specifice unei anumite boli, precum si teste functionale, acestea constituind in general apanajul unor laboratoare specializate.

Informatiile obtinute pe baza imunofenotiparii, in corelatie cu alte date clinice si de laborator, permit selectia testelor ulterioare necesare pentru diagnosticul de certitudine, in special teste genetice.

 – Imunodeficienta comuna variabila (CVID) include un grup heterogen de boli, avand prevalenta cea mai mare intre imunodeficientele primare. CVID se caracterizeaza prin anomalii ale limfocitelor B, au prezentare bimodala, in copilaria timpurie, respectiv intre 15-40 ani, 4 mutatii genetice diferite fiind asociate cu aceasta. Pacientii se prezinta cu infectii sino-pulmonare recurente, hipogamaglobulinemie globala si numar de limfocite B normal sau scazut, 5-10% din pacienti prezentand niveluri foarte scazute ale limfocitelor B (<1% din leucocite).

Un subset de pacienti (5-10%) dezvolta granuloame non-cazeoase sarcoid-like in diferite organe si o deficienta progresiva a limfocitelor T, in unele cazuri cu numar de limfocite T CD4+ <200/μL.

Dintre toti pacientii cu CVID, 25-30% prezinta un numar crescut de limfocite T CD8+ si raport CD4+/CD8+ scazut (<1).

 – Agamaglobulinemia se caracterizeaza prin debut la varsta de 4-6 luni, cu infectii sino-pulmonare si gastro-intestinale recurente, hipogamaglobulinemie globala, numar foarte scazut sau absenta limfocitelor B circulante, incapacitatea producerii de anticorpi ca raspuns la antigene, inclusiv vaccinuri, hipoplazia tesuturilor limfoide secundare.

In 85% din cazuri prezinta transmitere X-linkata si se caracterizeaza prin defecte ale expresiei Btk (Bruton`s tyrosine kinase) pe limfocite, monocite si trombocite ca urmare a unor mutatii la nivelul genei BTK.

Agamaglobulinemia X-linkata poate fi confundata cu CVID la adulti datorita suprapunerii principalelor caracteristici, insa numai 5% din cazurile de CVID prezinta <1% limfocite B CD19+ circulante.

Confirmarea diagnosticului se bazeaza pe evaluarea prin citometrie in flux a proteinei Btk, respectiv identificarea mutatiei la nivelul genei BTK.

 – Imunodeficienta severa combinata (SCID) este un sindrom cu potential letal, caracterizat prin infectii recurente, dermatita, diaree si esecul suptului. Este cauzat de defecte moleculare numeroase, care determina anomalii numerice si functionale ale limfocitelor B, T si, ocazional, NK, dar in majoritatea cazurilor limfocitele T sunt absente sau prezinta niveluri foarte scazute. Pe baza unui algoritm bazat pe prezenta sau absenta limfocitelor B si NK la pacientii cu niveluri foarte scazute sau absenta limfocitelor T, se pot selecta testele ulterioare necesare pentru stabilirea diagnosticului. Diagnosticul corect permite instituirea promta a tratamentului si, in ultima instanta, transplantul de maduva osoasa care asigura supravietuirea pacientului.

Un exemplu de SCID este sindromul Ommen, caracterizat prin diferentierea partiala a limfocitelor T datorita unei mutatii hipomorfe la nivelul genei RAG1 (recombinase activating gene 1) sau RAG2. La acesti pacienti, spre deosebire de pacientii cu mutatii care determina pierderea completa a functiei genei si la care lipsesc complet limfocitele B si T, pastreaza o activitate recombinanta V(D)J partiala si pot genera o cantitate substantiala de celule T oligoclonale. Totusi limfocitele B sunt complet absente si, in ciuda unui nivel crescut de IgE, nu poate fi detectat un raspuns de anticorpi antigen-specifici. Clinic sindromul se caracterizeaza prin dermatita, diaree, limfadenopatie, hepatosplenomegalie si susceptibilitate extrema la infectii. Pacientii prezinta limfocitoza prin prezenta unui set de celule TH2 oligoclonale activate antigen-stimulate, precum si eozinofilie.

Deficienta MHC clasa a II-a (initial cunoscuta ca sindromul limfocitelor goale) este o forma de SCID caracterizata prin absenta expresiei moleculelor MHC II pe suprafata celulara, cu numar normal de limfocite B si T, dar numar scazut de limfocite T CD4+. Pentru precizarea diagnosticului, prin citometrie in flux poate fi demonstrata absenta moleculelor MHC clasa II de pe suprafata celulelor prezentatoare de antigen, respectiv limfocitele B sau celulele de linie monocit-macrofag.

 – Sindromul DiGeorge este o imunodeficienta primara cu o frecventa de 1/3000 nasteri vii, caracterizata prin hipocalcemie datorata hipoparatiroidismului, defecte cardiace si hipoplazie sau aplazie timica. Acesta este cunoscut sub diferite nume: sindromul velo-cardio-facial, sindromul Shprintzen, CATCH 22, anomalia faciala conotruncala, toate reprezentand aceeasi conditie genetica, respectiv deletia cromozomului 22q11.2, care poate avea expresie clinica diferita. Sindromul DiGeorge “complet” cu absenta totala a timusului si imunodeficienta severa reprezinta <0.5% din pacienti. Majoritatea pacientilor au un defect partial cu alterarea dezvoltarii timusului si anomalii variabile ale limfocitelor T, cu o incidenta crescuta de infectii si boli autoimune. Imunodeficienta se datoreaza numarului scazut de limfocite T, al celulelor T reglatoare naturale (nTreg), si, desi numarul total de limfocite B este normal, este scazut numarul limfocitelor B de memorie.

Alte indicatii ale imofenotiparii limfocitare – profil de baza sunt:

 – Monitorizarea imuna dupa terapie imunosupresoare pentru transplant, boli autoimune, boli neoplazice.

Utilizarea majora a imunofenotiparii in transplant este reprezentata de monitorizarea tratamentului cu globulina anti-timocitara, un nivel de celule T CD3+ de 50/μL fiind considerat pragul pentru tratament.

– Evaluarea reconstituirii imune post-transplant de celule stem hematopoietice.

– Determinarea numarului absolut de celule B circulante la pacientii cu leucemie limfoida cronica, o valoare de >5×10⁹/L fiind necesara pentru diagnosticul de LLC conform ghidurilor 2008 pentru diagnostic si tratament in LLC.

Specimen recoltat – sange venos⁵. 

Recipient de recoltare – vacutainer ce contine EDTA ca anticoagulant⁵.

Volum proba – 5 mL sange³.

Stabilitate proba – sangele trebuie sa ajunga in maxim 24 ore la laboratorul la care se efectueaza testul si in aceasta perioada se pastreaza la temperatura camerei. Este contraindicata refrigerarea probei⁵.

Cauze de respingere a probei – specimene care au depasit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau congelate⁵.

Metoda – citometrie in flux⁵.

Valori de referinta si comunicarea rezultatelor

Buletinul final va contine intervalele de referinta pentru subseturile limfocitare adecvate varstei pacientului  impreuna cu o interpretare a rezultatelor obtinute⁵.

Trebuie cunoscut faptul ca numarul absolut al populatiilor limfocitare este influentat de o serie de factori biologici, inclusiv hormoni, temperatura si mediul inconjurator. Studiile legate de variatiile circadiane au demonstrat o crestere progresiva a numarului de celule CD4+ in cursul zilei, in timp ce limfocitele CD8+ si limfocitele B CD19+ cresc doar in prima parte a zilei, fara a se modifica in cursul dupa-amiezei. Din acest motiv, atunci cand se efectueaza o monitorizare seriata a populatiilor limfocitare se recomanda ca probele de sange sa se recolteze in acelasi moment al zilei⁸.

Bibliografie

1. ARUP Laboratories. Test Directory: Lymphocyte Subset Panel 5 – Total Lymphocyte Enumeration. www.aruplab.com 2010. Ref Type: Internet Communication.
2. Christopher S. Baliga, Mary E. Paul, Javier Chinen, William T. Shearer. HIV Infection and Acquired Immunodeficiency Syndrome. In Clinical Immunology. Principles and Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 571-582.
3. Kenneth Todar. Immune Defense against Bacterial Pathogens: Adaptive or Acquired Immunity. In Todar’s Online Textbook of Bacteriology. www.textbookofbacteriology.net/adaptive. Reference Type: Internet Communication.
4. Kimberley W. Sanford, Susan D. Roseff. Immunodeficiency Disorders. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods- Sauders Elsevier 21-Ed 2007, 906-913.
5. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.
6. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. T- and B-Lymphocyte Differential Profile. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication
7. Marie-Dominique Franco. Immunology, HIV and AIDS. http://www.biol.sc.edu/courses. Ref Type: Internet Communication.
8. Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. T- and B-Cell Quantitation by Flow Cytometry. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication
9. Paul A. Linnemeyer. The Immune System – An Overview, 2008. www.the body.com. Ref Type: Internet Communication.
10. Prof. Schlissel. The Immunology of HIV Infection and AIDS. http://mcb.berkeley.edu/courses. Ref Type: Internet Communication.
11. Robert R. Rich, Thomas A. Fleisher. William T. Shearer, Harry W. Schroeder, Anthony J. Frew, Cornelia M. Weyand. Fundamental Principles of the Immune Response. In Clinical Immunology. Principles and Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 3-127.
12. Shane Crotty, Rafi Ahmed. Immunological Memory. In Topley & Wilson Microbiology & Microbial Infections, Immunology, Hodder Arnold, 10th Edition, 2005, 487-503.