Borrelia-Anticorpi IgG,IgM Westernblot

Laborator Synevo

 

Informatii generale

Borrelia burgdorferi (B.b.) face parte din ordinul Spirochaetales, familia Spirochaetaceae, genul Borrelia si a fost izolata in 1982 din intestinul capusei Ixodes dammini, de Dr. Willy Burgdorfer al carui nume il poarta².

Studiul diferentelor antigenice dintre tulpinile izolate in America si Europa a permis recunoasterea implicarii in patologia umana a trei genospecii care alcatuiesc complexul Borrelia burgdorferi sensu lato: Borrelia burgdorferi sensu stricto (ce cuprinde toate tulpinile izolate in America de Nord), B. garinii siB. afzelii. In Europa circula toate cele trei genospecii, dar predomina B. garinii si B. afzelii^1;2;4. In plus fata de cele 3 genospecii mentionate s-a constatat recent implicarea, in unele cazuri din Europa, si a unei alte specii: Borrelia spielmanii³.

Odata cu descifrarea genomului bacterian al Borreliei s-au evidentiat numeroase antigene cu rol important in patogenie si diagnostic².

Acest test este folosit ca metoda de confirmare (confirma prezenta anticorpilor IgM si  IgG specifici fata de bacteriile apartinand grupului Borrelia burgdorferi sensu lato), a rezultatelor pozitive si echivoce obtinute la testele de screening imunoenzimatice^1;2;3;4.

Antigenele specifice sunt produse cu ajutorul unor tulpini de E coli recombinate. In comparatie cu lizatul conventional, folosirea proteinelor recombinate prezinta avantaj prin faptul ca este mimata exprimarea antigenica in vivo si este oferita in acelasi test o combinatie de antigene de la cele patru genospecii de Borrelia.

Spre deosebire de testele screening, testul de confirmare permite prin separarea electroforetica a antigenelor, o detectie a anticorpilor asociati cu diferite etape ale infectiei.  Astfel, antigenele OspC si  p41 sunt asociate cu raspunsul imun de tip IgM, in timp ce antigenele p100, p39 si p18 sunt markeri cert asociati cu raspunsul imun de tip IgG. Producerea de anticorpi fata de VlsE este detectata tot ca un raspuns de tip IgG^2;3;4.

Pregatire pacient – preferabil à jeun (pe nemancate)³.    

Specimen recoltat – sange venos³.

Recipient de recoltare – vacutainer fara anticoagulant cu/fara gel separator³.

Prelucrare necesara dupa recoltare – se separa serul prin centrifugare³.

Volum proba – minim 2 mL ser³.

Cauze de respingere a probei –  specimen intens hemolizat, hemolitic sau contaminat bacterian³.

Stabilitate proba –  2 saptamani la 2-8°C; timp indelungat la -20°C; evitati decongelarea/recongelarea repetata^.

Metoda – Western blot

Testul utilizeaza antigene Borrelia burgdorferi sensu lato recombinate si purificate, relevante serologic, care sunt separate pe baza greutatii moleculare prin electroforeza in gel de poliacrilamida in prezenta de sodium dodecil sulfat (SDS-PAGE) si transferate ulterior electroforetic pe o membrana de nitroceluloza (Western blotting). Situsurile de legare libere de pe membrana sunt saturate cu o solutie de proteine, dupa care matricea este spalata si taiata in fasii (strip-uri). Antigenele sunt reprezentate, in ordinea fixarii pe strip, de:

–p100: proteina inalt specifica provenita de la B. afzelii (integrata in peretele celular)

–VlsE: proteina de fuziune, reprezinta epitopii imunodominanti VlsE ai diferitelor genospecii

–P58: antigen specific inca necaracterizat provenit de la B. garinii

– p41: proteina flagelara provenita de la B. burgdorferi sensu stricto

–p39 (BmpA): proteina 39 asociata membranei, provenita de la B.afzelii

–OspA: proteina majora de suprafata, provenita de la B. afzelii

–OspC: zona ce contine 4 benzi impregnate cu proteine de suprafata provenite de la: B. garinii, B sensu stricto, B. afzelii si B. spilemanii

–p18: antigen de suprafata provenit de la B. sensu stricto, B. afzelii, B. garinii 1, B. garinii 2, B. spielmanii.

Pentru detectarea anticorpilor specifici anti-Borrelia strip-ul incarcat cu antigene este incubat impreuna cu serul diluat al pacientului. Daca in ser sunt prezenti anticorpi specifici acestia se vor lega de antigenele corespunzatoare de pe strip. Dupa o etapa de spalare, strip-ul este incubat, in functie de clasa de anticorpi testata, cu un conjugat anti-IgG sau anti-IgM uman marcat cu peroxidaza. Conjugatul se va atasa la complexul antigen-anticorp format. Dupa indepartarea prin spalare a conjugatului nelegat se adauga solutia de colorare – un sistem de detectie enzimatica colorimetrica care contine peroxid de hidrogen. Daca este prezent conjugatul legat, reactia enzimatica va genera un produs colorat albastru-inchis la nivelul benzilor ocupate de anticorpii specifici. Astfel, benzile vizualizate la nivelul stripului sunt rezultatul legarii anticorpilor specifici de antigenele individuale recombinate de la nivelul strip-ului³.

Valori de referinta  si interpretarea rezultatelor:

Fiecare strip contine in partea superioara 4 benzi de control:

-banda controlului de reactie, care trebui sa indice o reactie pentru fiecare ser testat;

-2 benzi pentru controlul conjugatului IgG/IgM; aceste benzi servesc drept control pentru clasa de anticorpi testata;  

-Controlul cut-off, pentru controlul procesului de colorare si evaluarea strip-ului.      

Pentru validarea testului trebuie sa se indeplineasca urmatoarele conditii:

-banda controlului de reactie sa fie intensa, de culoare inchisa,

-banda pentru controlul conjugatului corespunzator clasei de anticorpi testate (IgG sau IgM) sa prezinte o reactie de culoare clara; cealalta banda a conjugatului poate prezenta o reactie de culoare slaba, nespecifica;

-banda controlului cut-off sa fie de intensitate slaba, dar evidenta.

In functie de intensitatea benzii cut-off se evalueaza intensitatile celorlalte benzi; sunt posibile astfel urmatoarele exprimari semicantitative:

Intensitate banda	Exprimare rezultat
Absenta	–
Intensitate mai mica decat cea a controlului cut-off	+/-
Intensitate comparabila cu cea a controlului cut-off	+
Intensitate mai mare decat cea a controlului cut-off	++
Intensitate foarte mare	+++

Interpretarea definitiva a rezultatelor testului se face cu ajutorul unui software (dupa scanarea strip-urilor) care acorda un punctaj pentru fiecare banda a strip-ului care a fost evaluata ca +, ++, +++, astfel:

Antigen Borrelia	Puncte IgG	Puncte IgM
p100	5	5
VlsE	5	5
p58	4	4
p41	1	1
p39	5	4
OspA	5	5
OspC	5	8
p18	5	5

 Pentru antigenele OspC si p18 numarul de puncte se va lua in calcul doar o singura data, chiar daca sunt pozitive mai multe benzi.

In final este calculata suma  punctelor acordate si se va genera rezultatul testului:

Suma punctelor	Rezultat IgG	Rezultat IgM
≤ 5	Negativ	Negativ
6	Echivoc	Echivoc
≥ 7	Pozitiv	Pozitiv

 Un rezultat negativ nu exclude infectia cu Borrelia burgdorferi, in special la pacientii in stadiul I de boala cand  fie anticorpii nu sunt inca prezenti sau aparitia lor este intarziata din cauza unor tratamente cu antibiotice.

Un rezultat pozitiv nu indica o  boala Lyme activa in toate cazurile, deoarece anticorpii de tip IgG persista o perioada lunga de timp si pot proveni de la o infectie veche cu Borrelia.

In probele provenite de la pacienti aflati in primele stadii de boala, predomina anticorpii din clasa IgM, reactia fata de proteina OspC fiind caracteristica raspunsului imun precoce. In stadiile tardive ale bolii serul contine anticorpi de tip IgG, acestia determinand aparitia unor benzi intense in zonele p100, p58, p39 si p18. Anticorpii anti OspA sunt rar intalniti. Vlse este un marker precoce pentru raspunsul de tip IgG, dar insoteste adesea si raspunsul imun al manifestarilor tardive ale borreliozei, fiind prezent alaturi de p100 si/sau p18.

Prezenta anticorpilor anti-Borrelia in LCR este sugestiva pentru afectarea neurologica din boala Lyme³.

Limite si interferente

Prin folosirea unor antigene selective recombinate  de Borrelia se exclud  reactiile incrucisate care ar putea sa apara in urmatoarele infectii: sifilis, febra recurenta sau leptospiroza.

Totusi, in cazul unei  infectii active sau in antecedente cu Treponema pallidum serurile pot contine uneori anticorpi impotriva antigenelor  p41 sau p41/i, in aceasta situatie fiind necesare teste de excludere (VDRL si TPHA)².

La determinarea anticorpilor din clasa IgM  pot sa apara reactii nespecifice in prezenta infectiei cu virusul Epstein-Barr. La acesti pacienti, daca anamneza este neclara si raspunsul IgM slab pozitiv se recomanda excluderea infectiei EVB.

Este obligatoriu ca testele serologice  sa fie corelate intotdeauna cu anamneza si datele clinice.

Daca exista totusi suspiciune clinica de boala Lyme  si rezultatul obtinut la acest test  este negativ sau echivoc se  recomanda repetarea recoltarii dupa 3 saptamani¹.  

Bibliografie

1. Bettina Wilske, Barbara J.B. Johnson, Martin E. Schriefer: Borrelia In Manual of Clinical Microbiology. Patrick R. Murray, Ellen Jo Baron, James H. Jorgensen, Marie Louise Landry, Michael A.Pfaller, ASM PRESS, USA, 9 ed. 2007; 62: 971-987.
2. Koneman’s: Spirochetal Infections In Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, Lippincott Williams& Wilkins, 6 ed 2006; 20: 1125 – 1151.
3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog
4. Rocco LaSala P., Michael B. Smith: Spirochete Infections In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 21 ed. 2007; 58: 1059 – 1074.