Alergeni–testul de degranulare a bazofilelor BDT

Analize medicale

Informatii generale

Progresul tehnologic a furnizat laboratoarelor instrumente noi de cuantificare a anticorpilor IgE alergen-specifici atat in ser cat si pe suprafata bazofilelor.

Alaturi de determinarea in ser de IgE alergen-specifice prin metode automate standardizate au fost  dezvoltate si teste functionale care mimeaza in vitrocontactul dintre alergeni si celulele responsabile de aparitia simptomelor alergice  si care pun astfel in evidenta sensibilizarea de tip imediat.  Printre acestea se numara si testul de degranulare a bazofilelor (BDT) cu masurarea sulfidoleucotrienelor eliberate.

Pana nu demult s-a considerat ca bazofilele, care reprezinta doar un procent de 0.5% din totalul leucocitelor din sangele periferic, sunt doar forme circulante ale mastocitelor cu semnificatie minora. Date recente indica insa faptul ca bazofilele sunt clinic relevante si detin alaturi de mastocite un rol esential in raspunsul alergic de tip imediat. Prima orientare catre studii functionale ale bazofilelor a fost testul de eliberare a histaminei, insa beneficiul sau clinic a fost controversat datorita sensibilitatii si specificitatii reduse.

Testul efectuat in laboratorul nostru are o sensibilitate ridicata si, spre deosebire de masurarea IgE specifice in ser, determina si anticorpii IgE specifici legati de bazofile.

Mai mult, ca test clasic de “provocare”, BDT reprezinta singurul instrument diagnostic in vitro pentru studierea unui numar mare de reactii adverse la aditivi alimentari si medicamente (anestezice, antiiflamatoare nesteroidiene, antibiotice) care nu sunt IgE mediate (asa-zisele pseudo-alergii in care se produce cel mai adesea o degranulare celulara directa).

Avantajul este ca la BDT nu intervin mediatori preformati ca in cazul testului de eliberare a histaminei; in cazul existentei unei sensibilizari, leucotrienele sunt sintetizate abia dupa contactul cu alergenul. De asemenea testul nu este alterat printr-o eliberare toxica a mediatorilor preformati3;4;5.

Reactii adverse la aditivi alimentari

Aditivii sunt substante adaugate alimentelor sau preparatelor farmaceutice in scopuri multiple, vizand:

-conferirea unor calitati gustative (edulcorante, aromatizante, excitante si/sau secretorii);

-conservarea pe termen lung (antioxidanti, antibacteriene).

Numerosi aditivi au fost incriminati in producerea unei palete largi de reactii adverse, de la letargie pana la astm sever si anafilaxie. Urmatoarele substante au fost in mod extensiv analizate: coloranti sintetici, sulfiti, monosodium glutamat (MSG), aspartam si benzoati. Astfel, un studiu recent efectuat in Germania a estimat o prevalenta a reactiilor adverse la aditivi alimentari de 0.18%.

Unii aditivi alimentari sau farmaceutici au fost implicati in producerea astmului profesional, urticariei cronice sau dermatitei atopice. Cu toate acestea, multe din aceste reactii nu au fost confirmate prin proceduri diagnostice adecvate. Acest lucru se datoreaza faptului ca aditivii sunt in general molecule mici care determina manifestari clinice similare alergiei de tip imediat insa prin mecanisme non-IgE, cum ar activarea sistemului complementului si eliberarea directa a histaminei si leucotrienelor din leucocite (vezi figura).

BDT reprezinta un instrument pretios pentru diagnosticul pseudo-alergiilor la aditivi alimentari.

Fig 17.4.1 Pseudo-alergia la aditivi alimentari.

—-

In tabelul de mai jos sunt mentionati colorantii si aditivii alimentari pentru care sunt disponibile testele BDT, sursele care le contin, precum si principalele manifestari clinice induse de acestia2;6:

Denumire aditiv

Surse

Manifestari clinice

Tartrazina (E102)

Colorant galben azoic folosit la sucuri de fructe, prajituri, bomboane, medicamente

Cauza rara de urticarie cronica si angioedem

Galben-orange (E110; Sunset yellow)

Colorant galben-portocaliu azoic folosit la prajituri, bomboane, sosuri de branza, supe la plic, gemuri de caise, jeleuri, praf de budinca

Foarte rar urticarie, angioedem, bronhoconstrictie

Eritrozina (E127)

Colorant rosu de sinteza al prajiturilor si bomboanelor; contine iod

Factor agravant in rinita persistenta

Azorubina (E122)

Colorant rosu alimentar azoic

Implicare ocazionala in urticarie, angioedem, dermatita atopica, astm

Albastru patent (E121)

Colorant albastru sintetic pentru dulciuri

Implicare ocazionala in urticarie, angioedem, dermatita atopica, astm

Negru briliant (E151)

Colorant negru alimentar azoic (bomboane cu aroma de eucalipt)

Factor agravant pentru astm

Rosu “ponceau” (E124)

Colorant rosu azoic folosit la prepararea pudrelor pentru budinci cu gust de capsuni

Implicare ocazionala in urticarie, angioedem, dermatita atopica, astm

Amarant (E123)

Colorant rosu purpuriu azoic folosit la prepararea vinurilor si bauturilor racoritoare, cremelor de fructe si icrelor artificiale.

Implicare ocazionala in urticarie, angioedem, dermatita atopica, astm

Galben chinolin (E104)

Colorant galben sintetic non-azoic folosit la prepararea jeleurilor, medicamentelor

Implicare ocazionala in urticarie, angioedem, dermatita atopica, astm

Indigocarmin (E132)

Colorant albastru folosit la prepararea medicamentelor (capsule cu eliberare prelungita)

Implicare ocazionala in urticarie, angioedem, dermatita atopica, astm

Metabisulfit de potasiu (E224)

Conservant artificial pentru vinuri, fructe, legume, creveti; agent de albire; aditiv pentru medicamente

Rol stabilit in producerea bronhospasmului acut si astmului sever; implicare limitata in urticarie, angioedem, reactii anafilactoide

Acid benzoic (benzoat de sodiu) E211

Conservant, bacteriostatic si fungistatic in conditii de aciditate, folosit la muraturi, sucuri de legume si fructe; mai poate fi utilizat in siropuri de tuse

Urticarie cronica, angioedem, rinita persistenta, reactii anafilactoide

p-Hidroxibenzoat de propil (E216)

Esterul etil sintetic al acidului benzoic folosit drept conservant

Urticarie cronica, angioedem, rinita persistenta, reactii anafilactoide

Nitrit de sodiu (E250)

Conservant si antibacterian al produselor din carne (culoare roz), branzeturilor, heringilor

Posibila implicare in urticaria cronica si reactii anafilactoide

Salicilat de sodiu

Conservant alimentar

Bronhoconstrictie

Oxid rosu, galben si negru de fier (E172)

Colorant de suprafata (in capsulele cu medicamente)

 

Glutamat (E621)

Potentiator de aroma

Sindromul „restaurantului chinezesc”: palpitatii, cefalee, greata, dureri toracice, parestezii si senzatie de slabiciune, ameteli; poate induce bronhospasm la astmatici; poate fi implicat in rinita persistenta

 In cazul suspiciunii de intoleranta la aditivi alimentari (conservanti, antioxidanti, coloranti) se recomanda screening-ul pe 4 grupe de teste:

Amestec coloranti alimentari I: amarant, azorubin, galben chinolin, rosu „ponceau”, galben-orange.

Amestec coloranti alimentari II: eritrozina, albastru patent, indigocarmin, negru brilliant.

Amestec aditivi alimentari I: tartrazina, benzoat de sodiu, nitrit de sodiu, metabisulfit-K, salicilat de sodiu.

Amestec aditivi alimentari II: oxid de fier, acid benzoic, glutamat, hidroxibenzoat de propel.

Daca se obtine un rezultat pozitiv pentru unul dintre amestecuri, este posibila testarea individuala a a substantelor, dar dupa o noua recoltare3.

Reactii pseudo-alergice la medicamente

Sindroamele induse de medicamente care sunt sugestive pentru o reactie alergica de tip imediat dar la care nu poate fi demonstrat un mecanism imunologic sunt denumite reactii de hipersensibilizare non-alergica sau pseudo-alergii medicamentoase. Acestea constituie un subset de reactii idiosincratice care trebuie diferentiate clinic de reactiile imunologice (alergice) – vezi tabelul 17.4.2

Reactii imunologice (alergice)

Reactii idiosincratice (pseudo-alergice)

Anafilaxie dupa antibiotice beta-lactamice

Soc dupa substante radiologice de contrast

Hepatita indusa de halotan

Astmul indus de aspirina

Hipotensiunea dupa protamina

Urticaria asociata cu opiacee

Dermatita indusa de sulfonamide

Hipertensiunea pulmonara indusa de protamina

Boala serului produsa de fenitoin sau cefaclor

Urticaria asociata cu antiinflamatoare nesteroidiene

Hipotensiunea dupa succinil-colina

Anemia hemolitica datorata colinei

Trombocitopenia indusa de chinina

Sincopa dupa anestezice locale

Eruptie medicamentoasa fixa indusa de fenolftaleina

Eritemul din cursul infuziei cu vancomicina

Urticaria asociata cu cisplatin

Reactiile acute induse de ciprofloxacina

 Tabel 17.4.2 Exemple obisnuite de hipersensibilitate la medicamente

Majoritatea reactiilor pseudo-alergice implica aceeasi cale finala comuna ca si reactiile de tip I; in aceste cazuri (reactiile dupa substante radiologice de contrast, astmul indus de aspirina, urticaria asociata cu opiacee) bazofilele si mastocitele sunt activate prin mecanisme non-imunologice cu eliberarea de mediatori vasoactivi.

Multe dintre reactiile adverse atribuite substantelor de contrast se datoreaza hipertonicitatii acestora care faciliteaza eliberarea de histamina din mastocite si bazofile. Substantele mai noi, care nu contin iod, au un potential mai redus de pseudo-alergii dar pot asocia si acestea reactii severe, uneori mediate IgE.

Aspirina si celelalte AINS inrudite pot fi implicate in doua sindroame de hipersensibilitate non-alergica:

-astmul indus de aspirina: rinosinuzita eozinofilica cronica cu polipoza nazala si astm persistent;

-urticarie/angioedem declansate de aspirina.

Aceste reactii acute non-alergice sunt initiate ca urmare a inhibitiei ciclooxigenazei-1 de catre AINS. Ambele sindroame se caracterizeaza la nivel biochimic prin alterari profunde ale biosintezei eicosanoizilor, predominant prin productia excesiva de cisteinil-leucotriene si trebuie sa fie net diferentiate de alte reactii adverse la AINS prin mecanism alergic. Reactiile alergice se produc de obicei la un singur medicament antiinflamator sau la cateva medicamente cu structura chimica similara.

Reactiile pseudo-alergice la anestezice locale sunt intalnite mai ales in practica stomatologica. Cele mai alarmante sunt episoadele de sincopa vaso-vagala care pot mima anafilaxia. Paresteziile si ametelile pot fi explicate pe baza toxicitatii farmacologice a preparatelor, iar simptomele sunt mai frecvente la pacientii cu intoleranta la medicamente1.

Avand in vedere mecanismele mentionate, testul BDT poate avea un rol important in depistarea reactiilor pseudo-alergice la medicamente. In laborator este disponibila o paleta de alergeni standard care poate fi pusa in contact cu bazofilele pacientului:

Antibiotice

Amoxicilina

Ampicilina

Cefazolim

Cefuroxim

Ciprofloxacin

Claritromicina

Penicilina G

Penicilina V

Rifampicina

Sulmetoxazol

Trimetropim

Tetraciclina

 

Analgezice

Aspirina/Acid acetilsalicilic

Diclofenac

Ibuprofen

Acid mefenamic

Metamizol

Paracetamol

Fenilbutazona

Propifenazon

 

Anestezice

Lidocaina

Mepivacaina

Articaina

Prilocaina

Ubistezina

 

Blocanti musculari

Atracurium

Mivacurium

Pancuronium

Propofol

Rocuromium

Suxametoniu

Vecuronium

 

La acestea se adauga posibilitatea de a trimite o tableta sau o fiola dint-un medicament pentru a fi testat3.

Recomandari pentru efectuarea testului BDT

  1. Evidentierea unei sensibilizari de tip I in urmatoarele situatii clinice:

–  imposibilitatea efectuarii unui test cutanat datorita pericolului unei reactii anafilactice;

– in cazul suspiciunii clinice de alergie de tip imediat, desi Ig E specifice si testul cutanat sunt negative.

BDT este in special util pentru urmatorii alergeni:

   – venin de albina si viespe;

   – praf de casa;

   – par/epitelii de caine si pisica;

   – latex, formaldehida si alte chimicale;

   – alfa-amilaza (care induce astmul brutarilor!);

   – acrilati utilizati in stomatologie.

Mai jos sunt mentionati toti alergenii pentru care poate fi efectuat BDT in laboratorul nostru (cu exceptia medicamentelor si a aditivilor alimentari):

 Praf si acarieni

Dermatophagoides pteronyssinus d1

Dermatophagoides farinae d2

Acarus siro d70

Amestec de acarieni (Dermatophagoides pteronyssinus d1, Dermatophagoides farinae d2)

Amestec de acarieni (Acarus siro d70, Glycophagus domesticus d73, Lepidoglyphus destructor d71, Tyrophagus putreus d72)

Fungi

Alternaria alternata

Aspergillus fumigatus

Cladosporum herbarum

Penicillium notatum

Rhizopus nigricans

Trichophyton mentagrophytes

Stachybotris spp.

Candida albicans

Botrytis cinerea

Fungi amestec (Penicillium notatum m1, Cladosporium herbarum m2, Aspergillus fumigatus m3,    

Candida albicans m5, Alternaria alternata m6)

Insecte si paraziti

Venin albina i1

Venin viespe i3

Polistes spp. (viespe de hartie) i4

Vespa crabro (viespe europeana) i75

Anisakis

Materiale dentare                                                                                        Alergeni profesionali

Metil metacrilat (MMA)                                                                           Alfa-amilaza (astmul brutarilor)

2-Hidroxietil metacrilat (HEMA)                                                                         Diclofluanid

TEG-DMA                                                                                                                      Formaldehida

Bisfenol A                                                                                                                             Latex

Metacrilat de 1,4 butandiol (BDMA)                                                                       Lindan

N,N-dimetil-4-toluidina                                                                                            Permetrin

BIS-GMA                                                                                                     Anhidrida acidului ftalic                                                                         

Dimetilacrilat cu rasina diuretanica                                                         Pentaclorfenol (PCP)  

Etilenglicol dimetilacrilat                                                                          Tris-2-cloretil fosfat (TCEP)

Endometazona                                                                                             Tris-2-butoxiletil fosfat (TBEP)

Gutaperca                                                                                                BTX (benzen, toluen, xileni, etilbenzen)

Camforchinona                                                                                                               Clorpirifos

                                                                                                                        PCB (Bifenili policlorurati)                                                                                                 Amestec – PAK

Alimente

Alac                                                                                 Carne de porc                                              Crab

Asbus de ou                                                                 Carne de pui                                                 Crap

Alfa-lactalbumina                                                    Carne de rata                                               Creveti

Alune                                                                            Carne de vita                                               Drojdie

Ananas                                                                              Cartof                                                          Fistic

Arahide                                                                           Cazeina                                                    Galbenus de ou

Ardei                                                                               Capsuni                                                            Gluten

Avocado                                                                     Ceai negru                                                      Grapefruit

Beta-lactoglobulina                                                 Ceapa                                                                  Grau

Caracatita                                                                  Ciocolata                                                     Halibut (cambula)

Carne de curcan                                                         Cod                                                                 Hamei

Carne de gasca                                                         Conopida                                                         Homar

Carne de oaie                                                          Coriandru                                                            Kiwi

Lapte de vaca                                                                 Orez                                                          Secara

Langusta                                                                             Orz                                                            Soia

Lamaie                                                                            Ovaz                                                            Somon

Limba de mare                                                           Pastrav                                                        Spanac

Mandarina                                                                   Para                                        Sparanghel

Mazare                                                                        Pelinita                                                         Stridii

Mar                                                                               Piersica                                                      Struguri

Migdale                                                                      Piper negru                                                  Susan

Morcov                                                                     Portocala                                                       Telini

Nuca                                                                            Porumb                                                         Tipar

Nuca de Brazilia                                                     Rosie                                                            Usturoi

Nuci cashew                                                       Scortisoara                                                     Vanilie

Polen graminee

Cynodon dactylon g2 (pir gros)

Dactylis glomerata g3 (golomat)

Lolium perenne g5 (iarba de gazon)

Polen Phleum pratense g6 (timoftica)

Secale cereale g12 (secara)

Polen graminee amestec (Dactylis glomerata g3, Lolium perenne g5, Polen Phleum pratense g6, Festuca elatior g4, Poa pratensis g8, Holcus lanatus g13)

 Polen ierburi

Polen Artemisia vulgaris w6 (pelin)

Ambrosia elatior w1

Plantago lanceolata w9 (patlagina ingusta)

Parietaria officinalis w19 (parachernita)

Amestec ambrozie (Ambrosia elatior w1, Ambrosia psilostachya w2,  Ambrosia trifida w3)

Polen arbori

Alnus incana t2 (arin alb)

Polen Betulla verrucosa t3 (mesteacan)

Corylus avellana t4 (alun)

Quercus alba t7 (stejar alb)

Olea europaea (maslin)

  1. Evidentierea pseudo-alergiilor la aditivi si coloranti alimentari

– se testeaza 18 E-uri in 4 grupe sau, la cerere, in mod individual.

  1. Evidentierea reactiilor pseudo-alergice la medicamente

– pe langa alergenii standard pot fi testate si preparate native (tablete sau fiole trimise de medici/pacienti)3.

Avantajele testului BDT

-test de provocare in vitro cu relevanta clinica mare;

-detecteaza IgE alergen-specifice legate de celule, precum si degranularea directa prin mecanisme non-IgE;

-nu este influentat de eventuala prezenta a anticorpilor IgG alergen-specifici, care interfera cu determinarea de IgE specifice fata de anumite medicamente si alergeni alimentari;

-pot fi folositi si alergeni nativi.

Mentiune: performanta testului este similara cu cea a testului de activare a bazofilelor cu determinarea prin citrometrie in flux a markerului de degranulare CD633.

Pregatire pacient – se va evita administrarea de inhibitori ai degranularii mastocitare cat si corticoterapia cu 2-3 saptamani inaintea recoltarii probei3.

Specimen recoltat  sange venos3. 

Recipient de recoltare – vacutainer ce contine EDTA ca anticoagulant3.

Volum proba – cate 2 mL sange pentru fiecare alergen3.

Stabilitate proba  sangele trebuie sa ajunga in maxim 24 ore la laboratorul la care se efectueaza testul si in aceasta perioada se pastreaza la temperatura camerei. Este contraindicata refrigerarea probei3.

Cauze de respingere a probei – specimene care au depasit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau congelate3.

Metoda

Testul nostru constituie o dezvoltare a testului folosit anterior – CAST (Cellular Antigen Stimulation Test); imbunatatirea consta in concentrarea granulocitelor bazofile din proba inaintea adaugarii alergenului.

Analiza presupune urmatoarele etape (vezi figura 17.4.2):

  1. izolarea granulocitelor bazofile din sange recoltat pe EDTA;
  2. stimularea cu extractele alergenice respective;
  3. masurarea, in cazul sensibilizarii, a mediatorilor asociati histaminei (leucotriene).

Dupa separarea prin centrifugare in gradient de densitate Ficoll, se adauga interleukina-3 (IL-3) care creste exprimarea de receptori pe suprafata bazofilelor si faciliteaza astfel eliberarea crescuta de mediatori.

Pentru stimularea bazofilelor se pot folosi extracte de alergeni, alergeni recombinati sau alergeni nativi din preparatele furnizate de pacienti care nu prezinta toxicitate celulara. In plus fata de alergeni, bazofilele pacientului sunt incubate cu 2 controale:

-anticorpi monoclonali anti-IgE umane (controlul pozitiv) care leaga anticorpii IgE de pe suprafata bazofilelor si activeaza eliberarea de mediatori;

-o solutie tampon (controlul negativ) pentru estimarea eliberarii bazale spontane de mediatori.

Dupa incubare celulele sunt centrifugate, iar leucotrienele eliberate in urma stimularii bazofilelor se cuantifica printr-o tehnica ELISA in supernatantul rezultat. Nivelul net de mediatori eliberati este calculat apoi prin scaderea cantitatii de leucotriene eliberate spontan din nivelul de mediatori indus de alergeni sau de controlul pozitiv. Rezultatul se exprima in pg/mL3;5.

Interpretarea rezultatelor

  1. Rezultat negativ

< 200 pg/mL leucotriene dupa stimulare cu alergeni = nu exista sensibilizare de tip imediat 

       fata de preparatele testate.

  1. Rezultat pozitiv

>200 pg/mL leucotriene dupa stimulare cu alergeni = sensibilizare de tip I sau pseudo-alergie.

  1. Rezultat neconcludent

             Apare in situatia in care nu s-au obtinut criteriile de validare fie a controlului pozitiv

             (raspuns inadecvat <200 pg/mL leucotriene dupa stimulare cu anti-IgE), fie ale controlului

             negativ (nivel bazal crescut al eliberarii de mediatori). In conditiile in care recoltarea si

             transportul probei s-au efectuat in conditii adecvate, lipsa de validare a testului se poate

             datora:

       – tratamentului cu stabilizatori ai membranelor mastocitelor si bazofilelor;

       – unui nivel crescut al eliberarii spontane de mediatori ca urmare a unui proces alergic activ;

       – pacientul este un “non-releaser” (bazofilele nu raspund la stimulare – 10-15% dintre

       subiecti)3;5.

—-

Fig. 17.4.2 Etapele testului BDT

Bibliografie

  1. Gϋlfem Elif Çelik, Werner J Pichler, N Franklin Adkinson. Drug Allergy. In Middleton’s Allergy, Seventh Edition., Mosby Elsevier, 2009, 1215-1216.
  2. Ioan Bradu Iamandescu. Alergia alimentara si digestiva. In Alergologie – Fiziopatologie, diagnostic, tratament, editura All, 1998, 519-525.
  3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.
  4. Radhia Boumiza, Anne-Lise Debard, Guillaume Monneret. The basophil activation test by flow cytometry: recent developments in clinical studies, standardization and emerging perspectives. In Clinical and Molecular Allergy, 2005, 3:9.
  5. Robert G. Hamilton, N. Franklin Adkinson. In vitro assays for the diagnosis of IgE-mediated disorders. In Current Reviews of Allergy and Clinical Immunology, 2004.
  6. Robert K Bush, Steve L Taylor. Adverse Reactions to Food and Drug Additives. In Middleton’s Allergy, Seventh Edition., Mosby Elsevier, 2009, 1175-1185.

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată. Câmpurile obligatorii sunt marcate cu *